1株肉種鴨源金黃色葡萄球菌分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

申紅春

(恩施職業(yè)技術(shù)學(xué)院 ， 湖北恩施445000)

葡萄球菌屬于微球菌科中葡萄球菌屬，該菌廣泛分布在自然界中，可以引起雞、鴨、鵝、火雞、豬、兔等多種家禽、家畜發(fā)病，為臨床中重要人獸共患病病原菌。鴨葡萄球菌病是由金黃色葡萄球菌引起鴨的一種急性或慢性傳染病總稱(chēng)，該病可以感染不同品種、不同日齡的鴨，臨床上主要表現(xiàn)急性敗血癥、關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎、腳墊腫等，其中雛鴨最易感，主要表現(xiàn)急性敗血癥，死亡率較高，當(dāng)育成鴨和種鴨感染后，一般呈慢性經(jīng)過(guò)，主要表現(xiàn)關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎、腳墊腫等癥狀，該病對(duì)種鴨危害較嚴(yán)重，成為引起種鴨死淘率較高的重要疾病之一。

2018年6月，恩施地區(qū)某肉種鴨規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)，12周齡的肉種鴨出現(xiàn)采食減少、精神沉郁、兩翅下垂、縮頸，肉種鴨出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫大，不敢站立，跛行或跳躍式步行，在出現(xiàn)癥狀3～5天后開(kāi)始死亡，個(gè)別肉種鴨不表現(xiàn)任何的癥狀突然死亡。無(wú)菌采集死亡肉種鴨的肝臟、心血、關(guān)節(jié)滲出液等病料組織中分離到單一病原菌，被鑒定為金黃色葡萄球菌，因此，對(duì)從肉種鴨體內(nèi)分離到金黃色葡萄球菌進(jìn)行了致病性檢測(cè)和藥敏試驗(yàn)，為該病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 2018年6月，恩施地區(qū)某肉種鴨規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)中死亡的12周齡的肉種鴨，無(wú)菌采集死亡肉種鴨的肝臟、心血、關(guān)節(jié)滲出液等病料組織。

1.2 主要試劑與儀器 藥敏紙片，購(gòu)自北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；綿羊血培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯，均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司； Raid ID 32 STREP 陽(yáng)性菌鑒定試紙條，購(gòu)自Bio-Merieuxsa公司； DL-2 000 Marker、2×TaqMarker Mix，均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；PCR儀由德國(guó)Eppendorf 公司生產(chǎn)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱由自上海一恒科技儀器有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 12周齡健康肉種鴨10只，由恩施地區(qū)某肉種鴨規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)提供，飼養(yǎng)于恩施職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4 分離與培養(yǎng) 無(wú)菌采集死亡肉種鴨的肝臟、心血、關(guān)節(jié)滲出液等病料組織劃線接種于綿羊血培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12～18 h，挑取單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落接種于甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12～18 h。挑取單個(gè)菌落分別接種于普通培養(yǎng)進(jìn)行純化培養(yǎng)，并對(duì)純化培養(yǎng)的分離菌株進(jìn)行染色鏡檢。

1.5 生化鑒定 用比濁儀調(diào)整分離菌株菌液濃度為2個(gè)麥?zhǔn)蠞岫龋⒔臃N于Raid ID 32 STREP 陽(yáng)性菌鑒定試紙條中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，用ATB型自動(dòng)化微生物生化鑒定系統(tǒng)測(cè)定分離菌株的生化特性。

1.6 16S rRNA PCR鑒定 利用水煮法提取分離菌株的基因組DNA，用細(xì)菌16S rRNA通用引物5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′/5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′(由華大基因生物工程公司合成)對(duì)分離菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL：2×TaqMix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，57.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)分離菌株的目的條帶， 將PCR產(chǎn)物送華大基因生物工程公司進(jìn)行基因序列測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄基因序列進(jìn)行同源性比較。

1.7 致病性試驗(yàn) 取純化培養(yǎng)的分離菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，用菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，調(diào)整菌液濃度為106CFU/mL。試驗(yàn)組每只腹腔注射0.5 mL(106CFU/mL)，對(duì)照組給予等量的生理鹽水，試驗(yàn)組在攻毒12 h后，觀察7 d，記錄其發(fā)病情況和死亡情況。

1.8 藥敏試驗(yàn) 參照美國(guó)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行試驗(yàn)操作和結(jié)果判斷。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定結(jié)果 分離菌株在綿羊血培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出邊緣整齊的、圓形的、光滑的、帶透明的溶血環(huán)菌落，呈現(xiàn)β溶血；在甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出圓形的、大小一致的、淺黃色或者米黃色的菌落；在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出圓形的、白色的菌落，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，白色的菌落變成金黃色的菌落；染色鏡檢可見(jiàn)單個(gè)短鏈和成堆的葡萄串狀排列的陽(yáng)性球菌。與報(bào)道的金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)學(xué)一致。

2.2 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果 分離菌株V-P試驗(yàn)和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性，靛基質(zhì)試驗(yàn)陰性，分解葡萄糖、半乳糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖，且產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；分解馬尿酸鹽、還原硝酸鹽、精氨酸；不分解纖維二糖、阿拉伯糖、并水解淀粉、七葉苷，不產(chǎn)生H2S。ATB全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)中鑒定為金黃色葡萄球菌，評(píng)定合格率為99.9%。與報(bào)道的金黃色葡萄球菌的生化特性一致。

2.3 細(xì)菌16S rRNA PCR鑒定結(jié)果 分離菌株用細(xì)菌16S rRNA通用引物擴(kuò)增出大約為1 492 bp左右的目的基因的條帶(見(jiàn)圖1)，分離菌株的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的參考株10株金黃色葡萄球菌參考株的基因序列同源性為在99.9%～100.0%之間，從分子生物水平證實(shí)了分離菌株為金黃色葡萄球菌。

2.4 致病性試驗(yàn) 試驗(yàn)組肉種鴨攻毒后的2～3 d，出現(xiàn)了精神沉郁、食欲減退、呆立，3只肉種鴨出現(xiàn)死亡，至到4 d，試驗(yàn)組的肉種鴨死亡率100%；剖檢死亡的肉種鴨，從無(wú)菌采集病料組織中分離到金黃色葡萄球菌。對(duì)照組肉種鴨無(wú)明顯的癥狀，因而證實(shí)了分離到金黃色葡萄球菌對(duì)肉種鴨具有很強(qiáng)的致病性。

圖1 分離菌株16S rRNA PCR鑒定結(jié)果

M:DL-2 000 Marker ; 1～2:分離菌株

2.5 藥敏試驗(yàn) 由表1可知，分離菌株對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、慶大霉素、氟苯尼考5種藥物敏感；對(duì)氨芐西林、恩諾沙星、卡娜霉素、阿米卡星4種藥物中敏；對(duì)青霉素、阿莫西林、強(qiáng)力霉素、林可霉素、大觀霉素5種藥物耐藥。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

S：敏感，I：中敏，R：耐藥

3 討論

葡萄球菌根據(jù)脂溶性色素的生化反應(yīng)可以分為腐生葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌3類(lèi)型，其中金黃色葡萄球菌是引起肉種鴨葡萄球菌病的主要病原菌，該病一年四季均可發(fā)生，在高溫、多雨的季節(jié)或潮濕時(shí)節(jié)較為多發(fā)，其感染率和死亡率均較高，成為危害養(yǎng)鴨業(yè)主要細(xì)菌性疾病之一[1]。金黃色葡萄球菌可以分泌20多種毒性蛋白質(zhì)，該菌的致病性與其分泌或者產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶均有一定相關(guān)性，該菌可以引起化膿性疾病和毒素性疾病兩類(lèi)疾病[2]。金黃色葡萄球菌攜帶多種致病因子，α-溶血素主要毒力因子之一，可以產(chǎn)生毒素，并在金黃色葡萄球菌的致病和逃避機(jī)體免疫抑制過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，β-溶血素是該菌的主要致病因子之一，具有溶解紅細(xì)胞的特性，金黃色葡萄球菌溶血性與致病性密切相關(guān)[3]。近年來(lái)，關(guān)于鴨葡萄球菌病的發(fā)病呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，應(yīng)引起重視。

本試驗(yàn)從病死的肉種鴨體內(nèi)分離到了1株金黃色色葡萄球菌，通過(guò)人工感染肉種鴨驗(yàn)證其致病性，結(jié)果表明，分離到的一株金黃色葡萄球菌對(duì)肉種鴨致死率為100%。從而證實(shí)了金黃色色葡萄球菌是引起肉種鴨發(fā)病的主要病原菌。金黃色葡萄球菌菌的主要通過(guò)創(chuàng)傷傳播，也可通過(guò)消化道、呼吸道和臍帶感染，其中病禽和帶菌家禽是該病主要的傳染源，當(dāng)通風(fēng)不良、擁擠、斷喙、刺種疫苗、網(wǎng)刺等飼養(yǎng)管理不當(dāng)也可以引起該病發(fā)生與流行。在肉種鴨養(yǎng)殖過(guò)程中引起注意[1,4]。由于金黃色色葡萄球菌抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，沒(méi)有理想的疫苗，抗生素成為該病主要治療手段。本試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星等5種藥物敏感；對(duì)氨芐西林、恩諾沙星、卡娜霉素等4種藥物中敏；對(duì)青霉素、阿莫西林、強(qiáng)力霉素等5種藥物耐藥。當(dāng)肉種鴨發(fā)生該病時(shí)，應(yīng)通過(guò)藥敏試驗(yàn)選擇敏感的藥物，合理使用，提高治療療效，減少耐藥性產(chǎn)生。同時(shí)加強(qiáng)平時(shí)的飼養(yǎng)管理，注意環(huán)境中消毒。