寵物犬源致病性大腸桿菌鑒定血清型檢測與耐藥性分析

吳萍萍

(池州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 ， 安徽池州247000)

隨著人們生活質(zhì)量的提高，城市及農(nóng)村寵物犬的養(yǎng)殖數(shù)量越來越多，寵物犬成為人們?nèi)粘Ｉ钪兄匾閭H動物，寵物犬的健康受到人們的關(guān)注。寵物犬的腹瀉為臨床中常見的疾病之一，引起寵物犬腹瀉的病原主要有致病性大腸桿菌、沙門菌、綠膿桿菌、巴氏桿菌等，其中，致病性大腸桿菌是引起寵物犬腹瀉為臨床中常見的疾病。寵物犬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起初生幼犬急性腸道傳染性疾病，初生幼犬主要表現(xiàn)腹瀉敗血癥癥狀，成年犬感染致病性大腸桿菌后可引起泌尿系統(tǒng)感染、子宮炎和睪丸炎，還可以導(dǎo)致公犬的精子數(shù)量下降，致病性大腸桿菌嚴(yán)重危害寵物犬的健康[1-2]。大腸桿菌廣泛存在環(huán)境中，是一種重要的人獸共患病原菌，且該菌血清型眾多，許多動物具有相同的血清型，但不同地區(qū)流行的血清型不同[3-4]。在寵物犬源大腸桿菌病治療過程中，由于不合理使用抗生素，寵物犬源大腸桿菌對抗生素也產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性，應(yīng)引起重視[6]。

本試驗(yàn)從安徽池州地區(qū)寵物醫(yī)院中，無菌采集腹瀉寵物犬肛拭子和糞便樣品63份分離得到了30株大腸桿菌。對分離的30株大腸桿菌的致病性、血清型及耐藥性進(jìn)行了檢測分析，為該地區(qū)的寵物犬源致病性大腸桿菌病的防治提供一定的指導(dǎo)意義。

1 材料

1.1 病料來源 從安徽池州地區(qū)26家寵物醫(yī)院中，采集腹瀉寵物犬肛拭子和糞便樣品63份，無菌采肛拭子和糞便，裝入含滅菌PBS試管標(biāo)記。

1.2 主要試劑 滅菌PBS試管、7%動物血培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片，購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；ID32E腸道菌鑒定試劑條(法國梅里埃公司)；E.coli標(biāo)準(zhǔn)O型血清因子、0.5%石炭酸生理鹽水，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；常規(guī)的試劑和儀器均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 體重22 g左右健康昆明系小鼠155只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)菌的分離鑒定 對無菌采集的肛拭子和糞便混勻，接種7%動物血培養(yǎng)基上，置37 ℃恒溫箱培養(yǎng)12～18 h，選取單個優(yōu)勢菌落接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)12 h。挑取伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上優(yōu)勢單個菌落接種于營養(yǎng)肉湯中純化培養(yǎng)，置37 ℃搖床震蕩培養(yǎng)12 h，對純化培養(yǎng)的分離菌株進(jìn)行革蘭染色顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)。

2.2 細(xì)菌的生化試驗(yàn) 取純化培養(yǎng)的分離菌株，按說明書要求加入ID32E腸道菌鑒定試條中，置37 ℃培養(yǎng)24 h，用ATB自動生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化試驗(yàn)特性鑒定。大腸桿菌的生化特性試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)(見表1)。

2.3 分離菌株的致病性試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[5]，將體重22 g左右健康昆明系小鼠155只分成31組，每組5只，每1株大腸桿菌分離菌株通過灌胃方式攻毒1組小鼠，灌胃的劑量為 0.5 mL(108CFU/mL)/只，對照組給予等量的滅菌的生理鹽水。各個試驗(yàn)組攻毒12 h后并觀察7 d，記錄發(fā)病及死亡情況，并對于死亡的小鼠進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

2.4 分離株血清型鑒定 參考文獻(xiàn)[6]，采用玻片凝集試驗(yàn)鑒定致病性大腸桿菌的血清型，取20株致病性大腸桿菌液接種于營養(yǎng)肉湯中，置37 ℃搖床震蕩培養(yǎng)12 h后，經(jīng)過121 ℃高壓滅菌2 h，破壞致病性大腸桿菌K抗原。冷卻后用標(biāo)準(zhǔn)血清單因子進(jìn)行玻板凝集反應(yīng)，同時以O(shè)抗原與5 g/L石炭酸生理鹽水作為對照。

表1 大腸桿菌生化特性試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

+：陽性；-：陰性

2.5 分離菌株的藥敏試驗(yàn) 按照美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行操作、結(jié)果判斷。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌的分離鑒定結(jié)果 無菌采集腹瀉寵物犬肛拭子和糞便樣品63份，30株分離菌株7%動物血培養(yǎng)基上長出具有白色、濕潤、邊緣光滑整齊的圓型的菌落；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上長出深紫黑色或者褐色、帶金屬光澤、大小一致的圓形菌落；革蘭染色鏡檢，分離菌株為陰性、兩端鈍圓的桿狀菌。與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》報道的大腸桿菌培養(yǎng)特性和形態(tài)學(xué)一致。

3.2 分離株生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果 大腸桿菌生化特性30株分離菌株均發(fā)酵甘露醇、葡萄糖、海藻糖、麥芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖，能產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，V-P試驗(yàn)為陰性、吲哚試驗(yàn)為陽性。用ID32E腸道菌鑒定試劑條和ATB全自動生化鑒定系統(tǒng)檢測分析(表1)，結(jié)果顯示，30株分離菌株與大腸桿菌評定結(jié)果合格率為99.9%～100.0%。與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》報道大腸桿菌生化特性一致。

3.3 致病性試驗(yàn) 第1～30組小鼠在攻毒后的24～72 h，出現(xiàn)了食欲減退、消瘦，扎堆，腹瀉，發(fā)病率為100%；通過致病試驗(yàn)分析，20株大腸桿菌分離株能使小鼠致死，剖檢死亡小鼠，從小鼠肝臟中分離到大腸桿菌。其中，對照組5只小鼠未出現(xiàn)明顯的變化，因而證實(shí)了20株大腸桿菌分離株為致病菌株。

3.4 分離菌株血清型鑒定結(jié)果 由表2可知，20株致病性大腸桿菌分離株中，定型的大腸桿菌為18株，定型大腸桿菌菌株為90%，2株未鑒定出血清型。18株致病性大腸桿菌分離株8種不同的血清型，以O(shè)8和O13為該地區(qū)流行的優(yōu)勢血清型，分別占分離株的25%、20%。

表2 致病性大腸桿菌分離株血清型鑒定結(jié)果

3.5 分離株耐藥性分析結(jié)果 20株致病性大腸桿菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果由表3可知，20株致病性大腸桿菌分離株均對頭孢克肟、頭孢曲松、恩諾沙星、丁胺卡那霉素4種藥物高度敏感；敏感性在50%～80%；其中，對氟苯尼考、磺胺間甲氧嘧啶、新霉素、青霉素、阿莫西林、氨芐西林、多黏菌素7種藥物的耐藥率50%～90%之間；其他的藥物耐藥率在5%～20%之間。

表3 20株E.coli 分離株對18種耐藥性分析結(jié)果(n=20)

4 討論

寵物犬大腸桿菌病引起初生幼犬急性腸道傳染病，臨床以腹瀉和敗血癥為主要癥狀，嚴(yán)重危害著寵物的健康[1-2]。本試驗(yàn)從安徽池州地區(qū)26家寵物醫(yī)院中，采集腹瀉寵物犬肛拭子和糞便樣品63份分離得到了30株大腸桿菌。其中，通過動物致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，20株大腸桿菌為致病性大腸桿菌，說明該地區(qū)寵物犬感染致病性大腸桿菌比較嚴(yán)重。大腸桿菌是一種廣泛存在環(huán)境中的條件致病菌，可以通過多種途徑感染宿主，主要以呼吸道和消化道為主[6]。尤其是剛出生的寵物幼犬免疫系統(tǒng)不健全，免疫力較低易感染大腸桿菌，在寵物幼犬養(yǎng)殖過程中應(yīng)注意周圍環(huán)境衛(wèi)生，定期消毒，減少環(huán)境中大腸桿菌感染寵物幼犬。大腸桿菌血清型眾多，不同地區(qū)流行血清型情況不同，其致病性也不同。本試驗(yàn)對分離的20株致病性大腸桿菌進(jìn)行血清型檢測，以O(shè)8和O13為優(yōu)勢血清型。張美君等[7]報道了從廣州市5家寵物醫(yī)院病犬、貓直腸拭子樣品中分離177株大腸桿，其中以O(shè)1、O2和 O8為主要的流行血清型。文英[8]報道了從西寧市寵物醫(yī)院中分離到了寵物犬源大腸桿菌80株，以O(shè)157、O24、O10、O644種血清型為流行的優(yōu)勢血清型。因而，證實(shí)了寵物犬源致病性大腸桿菌的血清型具有一定區(qū)域流行性。

寵物犬源大腸桿菌病在臨床治療中耐藥的問題報道越來越多，尤其是氟苯尼考藥物耐藥嚴(yán)重[7]。20株致病性大腸桿菌分離株均對頭孢克肟、頭孢曲松、恩諾沙星、丁胺卡那霉素4種藥物高度敏感；對氟苯尼考、磺胺間甲氧嘧啶、新霉素7種藥物產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性。當(dāng)寵物犬感染致病性大腸桿菌時，應(yīng)通過藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選擇敏感的藥物進(jìn)行治療，才能取得良好的治療效果。