河南省種雞場(chǎng)雞白痢沙門菌的耐藥性分析

徐耀輝 ， 齊亞如 ， 周俊豪 ， 王明瑜 ， 陳 益 ， 蔣增海 ， 鄧同煒 ， 李文剛

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 河南鄭州450046)

雞白痢是由雞白痢沙門菌引起的一種重要的禽類傳染病，可造成幼雛大量死亡、產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋下降、種蛋孵化率降低，弱雛率增加。沙門菌既可經(jīng)飲水、飼料甚至媒介生物水平傳播，也可經(jīng)受精卵垂直傳播[1]。我國(guó)對(duì)雞沙門菌病非常重視，將其列為16種優(yōu)先防治的動(dòng)物疫病之一?！秶?guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012～2020年)》提出， 2020年全國(guó)所有種雞場(chǎng)沙門菌病達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)。由于至今仍沒有一個(gè)理想的疫苗上市，并且嚴(yán)格的生物安全措施在相當(dāng)數(shù)量的養(yǎng)殖場(chǎng)難以實(shí)現(xiàn)，為防治包括沙門菌病在內(nèi)的細(xì)菌性疾病，抗菌藥物在臨床上仍廣泛應(yīng)用甚至濫用，使得動(dòng)物源細(xì)菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)細(xì)菌性疾病的防控乃至公共衛(wèi)生受到了嚴(yán)重挑戰(zhàn)。目前，關(guān)于河南省雞白痢沙門菌耐藥狀況的報(bào)道資料較少。本試驗(yàn)對(duì)2014年7月-2015年8月分離自河南省6個(gè)地區(qū)12個(gè)雞場(chǎng)的395株雞白痢沙門菌進(jìn)行耐藥表型及耐藥基因檢測(cè)，以了解沙門菌耐藥狀況及耐藥規(guī)律，為進(jìn)一步了解耐藥產(chǎn)生機(jī)制，指導(dǎo)科學(xué)使用藥物、防控雞沙門菌病提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 2×TaqMaster Mix、DNA Marker DL-2 000，均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；MH瓊脂及藥敏紙片，購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；麥?zhǔn)媳葷峁?，?gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。擴(kuò)增耐藥基因所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)菌株 標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸桿菌ATCC25922由江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；395株雞白痢沙門菌均為2014-2015年分離自河南省6個(gè)地區(qū)共12個(gè)種雞場(chǎng)自帶孵化場(chǎng)的死胚樣品。鄭州地區(qū)6個(gè)場(chǎng)(ZZ1、ZZ2、ZZ3、ZZ4、ZZ5、ZZ6)；許昌地區(qū)1個(gè)場(chǎng)(XC1)；商丘地區(qū)1個(gè)場(chǎng)(SQ1)；平頂山地區(qū)1個(gè)場(chǎng)( PDS1)；漯河地區(qū)2個(gè)場(chǎng)(LH1、LH2)；信陽地區(qū)1個(gè)場(chǎng)(XY1)。分離菌株由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院獸醫(yī)傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 藥敏紙片 試驗(yàn)所用20種藥敏片均為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品，詳見表1；ESBLs初篩及確證試驗(yàn)所用藥敏紙片頭孢他啶(CAZ，30 μg/片)、頭孢他啶/克拉維酸(3∶1) (CAZ/CA，30/10 μg/片)、頭孢噻肟(CTX，30 μg/片)、頭孢噻肟/克拉維酸(3∶1)(CTX/CA，30/10 μg/片)，均購(gòu)自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.4 藥敏試驗(yàn)及ESBLs確證試驗(yàn) 按照K-B法和美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical Laboratory Standards Institute，CLSI)手冊(cè)[2]進(jìn)行抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)和產(chǎn)ESBLs菌的篩選及確證試驗(yàn)。以E.coli(ATCC25922)為質(zhì)控菌株，試驗(yàn)結(jié)果按照手冊(cè)[2]要求進(jìn)行判讀。

1.5 耐藥基因的PCR檢測(cè) 根據(jù)耐藥表型不同，擴(kuò)增相應(yīng)的37種耐藥基因。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶類(Extended-Spectrum Beta-Lactamases，ESBLs)12種：TEM，SHV，CTX-M-1，CTX-M-2，CTX-M-3，CTX-M-8，CTX-M-9，CTX-M-25，OXA-1，OXA-2，OXA-10，PSE；氨基糖苷類10種：armA，rmtA，rmtB，rmtC，rmtD，rmtE，npmA，aac(3)-IV，aac6'-Ib，aadA1-like；頭孢菌素類6種：MOX，CIT，DHA，ACC，EBC，F(xiàn)OX；磺胺類3種：sul1，sul2，sul3；四環(huán)素類6種：tetA，tetG，tetX，tetB，tetC，tetR。引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)條件見參考文獻(xiàn)[3]，擴(kuò)增后隨機(jī)選取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和序列比較。

2 結(jié)果

2.1 雞白痢沙門菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 分離株對(duì)磺胺異噁唑耐藥率最高(74.18%)，對(duì)氨芐西林(50.89%)、四環(huán)素(44.56%)、土霉素(43.05%)3種藥物耐藥率較高，對(duì)15種抗菌藥的耐藥率均在7%以下，其中對(duì)多粘菌素E、美羅培南、亞胺培南全為敏感。盡管分離菌株對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率不高(1.27%)，但有較大比例(88.19%)的菌株表現(xiàn)為中介。詳細(xì)結(jié)果見表1。經(jīng)ESBLs初篩和確證試驗(yàn)，有2株分離菌株產(chǎn)ESBLs。

2.2 雞白痢沙門菌耐藥性的雞場(chǎng)分布 在檢測(cè)的12個(gè)雞場(chǎng)中，所有雞場(chǎng)均能檢測(cè)到耐磺胺異噁唑的菌株，11個(gè)雞場(chǎng)檢測(cè)到耐四環(huán)素、土霉素的菌株，9個(gè)雞場(chǎng)檢測(cè)到對(duì)氨芐西林耐藥的菌株，8個(gè)場(chǎng)檢測(cè)到耐磺胺甲噁唑/甲氧芐啶藥的菌株，7個(gè)場(chǎng)檢測(cè)到耐頭孢唑啉的菌株。出現(xiàn)對(duì)環(huán)丙沙星(3個(gè))、頭孢曲松(3個(gè))、呋喃妥因(3個(gè))、氯霉素(1個(gè))、恩諾沙星(1個(gè))耐藥菌株的雞場(chǎng)數(shù)量較少。菌株耐藥率在各個(gè)場(chǎng)之間差異較大，比如， ZZ6、XC1、SQ1分離菌株耐氨芐西林嚴(yán)重(耐藥率超過90%)，而其他場(chǎng)菌株耐藥率較低或不耐藥。ZZ1、ZZ3、ZZ5、ZZ6場(chǎng)菌株對(duì)四環(huán)素、土霉素耐藥嚴(yán)重(耐藥率超過65%)；對(duì)于磺胺甲噁唑/甲氧芐啶，ZZ1、ZZ3、ZZ5場(chǎng)菌株耐藥率均超過65%，而有8個(gè)場(chǎng)分離菌株耐藥率低于10%。

2.3 不同場(chǎng)區(qū)來源的雞白痢沙門菌耐藥譜比較 鄭州地區(qū)6個(gè)場(chǎng)來源菌株除了ZZ6場(chǎng)較為復(fù)雜，主要耐藥譜為青霉素類-四環(huán)素類-磺胺類(56.38%)外，其余5個(gè)場(chǎng)分離菌株主要耐藥譜均為四環(huán)素類-磺胺類；其余5個(gè)地區(qū)的6個(gè)雞場(chǎng)分離株主要耐藥譜均為青霉素類-磺胺類，其中SQ1場(chǎng)出現(xiàn)最廣泛耐藥譜，可耐8類14種抗生素。

2.4 雞白痢沙門菌耐藥譜檢測(cè)結(jié)果 雞白痢沙門菌3重以上耐藥的有110株，占27.84%，以3重耐藥的青霉素類-四環(huán)素類-磺胺類耐藥譜型比例最高，占19.49%，最高可出現(xiàn)8重耐藥。詳見表2。

表1 藥敏紙片種類與檢測(cè)結(jié)果

表2 雞白痢沙門菌多重耐藥譜

2.5 雞白痢沙門菌耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果 共檢測(cè)出12種耐藥基因；2株產(chǎn)ESBLs菌株均檢測(cè)到TEM 1種耐藥基因；8株耐氨基糖苷類的菌株檢測(cè)到aac(3)-IV、aadA1-like 2種耐藥基因；27株耐頭孢菌素類的菌株檢出MOX、ACC、DHA、CIT四種耐藥基因；294株耐磺胺類菌株檢出sul1、sul2、sul3三種耐藥基因；177株耐四環(huán)素類的菌株共檢出tetA、tetR兩種耐藥基因，tetA為優(yōu)勢(shì)耐藥基因；各種耐藥基因的檢出率見圖1。

2.6 雞白痢沙門菌耐藥基因型的檢測(cè)結(jié)果 本研究中5類耐藥表型的菌株均可檢出一種或多種相關(guān)耐藥基因，且耐藥表型和基因型的符合率均在83%以上，見表3。

圖112種耐藥基因的檢出情況

表3 雞白痢沙門菌耐藥基因型的分析結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)河南省新近分離的395株雞白痢沙門菌進(jìn)行20種抗菌藥物的耐藥性檢測(cè)，結(jié)果表明，分離菌株耐藥率超過40%的有4種，分別是磺胺異噁唑(74.18%)、氨芐西林(50.89%)、四環(huán)素(44.56%)、土霉素(43.05%)，這與鄒明等[4]、王德寧等[5]、孫瑜[6]、劉新靜[7]報(bào)道的北京、陜西、哈爾濱、河北等地區(qū)的雞源性沙門菌耐藥情況基本一致。這些人獸共用藥物長(zhǎng)期被廣泛用于我國(guó)的畜禽養(yǎng)殖中，藥物的選擇壓力使細(xì)菌產(chǎn)生了相當(dāng)高的耐藥性，臨床上應(yīng)減少或暫停使用，避免耐藥基因在人類和動(dòng)物病原菌間傳播，進(jìn)而通過食物鏈對(duì)公共衛(wèi)生造成威脅。

本試驗(yàn)的395株雞白痢沙門菌對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥率(小于3%)明顯低于王德寧[5]和孫瑜[6]的報(bào)道，可能是氨基糖苷類藥物在涉及的養(yǎng)殖場(chǎng)使用較少。本試驗(yàn)所有菌株對(duì)獸醫(yī)禁用的美羅培南、亞胺培南、多黏菌素E均不耐藥，對(duì)氯霉素(1.01%)、呋喃妥因(1.52%)耐藥率較低，表明加強(qiáng)獸藥管理可以有效減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。β內(nèi)酰胺酶抑制劑(如克拉維酸)能與產(chǎn)酶菌產(chǎn)生的β內(nèi)酰胺酶發(fā)生不可逆結(jié)合而使其失去水解抗生素的能力，本試驗(yàn)中，當(dāng)阿莫西林與酶抑制劑聯(lián)用后，它們的抗菌活性顯著增強(qiáng)，產(chǎn)酶菌耐藥率顯著下降(從對(duì)氨芐西林的耐藥率50.89%到對(duì)阿莫西林-克拉維酸的耐藥率0.25%)，表明在控制產(chǎn)酶耐藥菌感染方面，β內(nèi)酰胺類與酶抑制劑聯(lián)用可能是一種有效方法。

本試驗(yàn)中菌株對(duì)磺胺異噁唑的耐藥率達(dá)到74.18%，而對(duì)磺胺甲噁唑/甲氧芐啶耐藥率為17.97%，表明加入增效劑后可明顯增強(qiáng)抗菌藥物的抑菌效果。菌株對(duì)氟喹諾酮類藥耐藥率雖較低，但表現(xiàn)中介的比例較高，尤其是環(huán)丙沙星的中介率高達(dá)88.19%，預(yù)示著中介菌株轉(zhuǎn)化為耐藥菌株的風(fēng)險(xiǎn)較大[8]，提示我們生產(chǎn)中要科學(xué)合理使用。

本試驗(yàn)中，來源于相同地區(qū)的菌株耐藥譜較為相似，部分雞場(chǎng)的主要耐藥表型呈現(xiàn)一致。如鄭州地區(qū)的6個(gè)場(chǎng)中有5個(gè)場(chǎng)存在一個(gè)主要的耐藥表型：耐四環(huán)素類-磺胺類，另外1個(gè)場(chǎng)(ZZ6)不同。其他5個(gè)地區(qū)的6個(gè)場(chǎng)分離菌株耐藥譜主要為耐青霉素類-磺胺類，SQ1場(chǎng)菌株耐青霉素類-四環(huán)素類-磺胺類也有較高比例(32.76%)。不同地區(qū)的菌株可能有相似或相近的耐藥譜[9-10]，不同場(chǎng)區(qū)之間沙門菌的耐藥性可能與用藥習(xí)慣緊密相關(guān)。

本試驗(yàn)中27株耐頭孢類的菌株共檢出MOX(66.67%)、DHA(51.85)、ACC(81.48%)、CIT(0.37%)四種耐藥基因，與匡秀華[11]報(bào)道的DHA(14.97%)、CIT(2.14%)檢測(cè)結(jié)果不一致；177株耐四環(huán)素類的菌株共檢出tetA (82.49%)、tetR(8.47%)兩種耐藥基因，與戴建華等[12]報(bào)道的禽源沙門菌耐藥基因tetA (59.09%)、tetB(50%)、tetC(68.18%)的檢測(cè)結(jié)果不一致；294株耐磺胺類菌株共檢出sul1(22.11%)、sul2(68.71%)、sul3(49.66%)三種磺胺類耐藥基因，與薛原等[13]報(bào)道的雞源沙門菌耐藥基因sul1(100%)、sul2(68.6%)、sul3(94.3%)的檢測(cè)結(jié)果不一致；表明在沙門菌產(chǎn)生耐藥性過程中不同耐藥基因的參與程度存在差異。另外，少部分具有耐藥表型的菌株沒有檢測(cè)到本文所列的耐藥基因，表明耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，有待于進(jìn)一步研究。