豬圓環(huán)病毒2型RPA恒溫?cái)U(kuò)增檢測方法的建立及初步應(yīng)用

黃超華 ， 張全紅 ， 曹琛福 ， 王 瀟 ， 林彥星 ， 史衛(wèi)軍 ， 花群義

(1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局 動植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心 ， 廣東深圳518045 ； 2.國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心 ， 北京昌平100096)

豬圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，分為豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)以及2016年新發(fā)現(xiàn)的豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)[1]。其中，豬圓環(huán)病毒2型呈世界流行性，在我國豬群中也有較高的感染率[2]，對我國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)影響巨大。豬圓環(huán)病毒2型是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)以及豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVAD)如豬皮炎和腎病綜合征、PCV2相關(guān)性肺炎、繁殖障礙和腸炎等的主要致病因子[6]。同時(shí)，PCV2經(jīng)常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬偽狂犬病病毒(PRV)等形成混合感染，相互增強(qiáng)毒力，造成感染豬群免疫抑制，使感染豬場的防控與防治更加復(fù)雜與困難，從而嚴(yán)重影響?zhàn)B豬場的生產(chǎn)效益[3]。

目前國內(nèi)外研究人員已建立了多種PCV2的檢測方法，如病毒分離、常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)以及間接免疫熒光(IFA)等檢測技術(shù)[9]。而本試驗(yàn)所使用的重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)技術(shù)是英國公司TwistDxInc于2006年研發(fā)的一種核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，能夠在15～20 min內(nèi)進(jìn)行常溫下(37 ℃～42 ℃)的核酸檢測。該方法擴(kuò)增效率極高，反應(yīng)體系中的重組酶與引物結(jié)合形成蛋白-DNA復(fù)合物，與核酸模板上的同源序列結(jié)合，同時(shí)在單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)協(xié)助下，DNA聚合酶引導(dǎo)產(chǎn)生解鏈和DNA合成，最終形成新的DNA雙鏈，從而實(shí)現(xiàn)高效擴(kuò)增[4-5]。RPA擴(kuò)增的速度非常快，靈敏度高，對硬件設(shè)備要求低，而且不需要復(fù)雜的樣本處理。與其他核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相比，RPA 技術(shù)不需熱變性，因此反應(yīng)時(shí)間更短，可以多通道同時(shí)檢測多個(gè)靶基因，而且有多種方法可用來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，其中實(shí)時(shí)熒光RPA通過與熒光探針結(jié)合實(shí)現(xiàn)對DNA擴(kuò)增情況進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測。因此，RPA技術(shù)有更廣闊的應(yīng)用價(jià)值，其中，RPA 技術(shù)在病原學(xué)檢測領(lǐng)域的研究尤為熱門，至今已經(jīng)建立了針對細(xì)菌、病毒、寄生蟲等多種病原體的RPA 檢測方法[7-12]。本試驗(yàn)選取PCV2cap基因保守序列為靶基因，設(shè)計(jì)并篩選出一組引物探針組合，成功建立了一種用于檢測豬圓環(huán)病毒2型的重組酶聚合酶恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測方法，并進(jìn)行了初步應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料 病毒：豬圓環(huán)病毒2型(PCV 2)、豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)及豬瘟病毒(CSFV)弱毒疫苗均由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心提供和保存。臨床樣品：采自豬場或送檢的豬血液、淋巴結(jié)、脾、肺、腎組織等臨床樣品共183份。細(xì)胞：PK15細(xì)胞、Marc145細(xì)胞由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心傳代和保存。主要試劑和儀器：病毒核酸抽提試劑盒及全自動磁珠提取純化系統(tǒng)，美國Thermo公司產(chǎn)品；超微量核酸蛋白濃度分析儀，英國BioDrop公司產(chǎn)品；TwistAmp?exo kit，英國TwistDx公司產(chǎn)品；等溫?cái)U(kuò)增儀T16-ISO，澳大利亞Axxin公司產(chǎn)品；7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀，美國ABI公司產(chǎn)品。引物與探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 引物和探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)英國TwistDx公司RPA引物和探針設(shè)計(jì)原則，本研究參考NCBI GenBank中公布的PCV2病毒的cap基因序列，通過比對cap基因中的保守序列，設(shè)計(jì)出多條特異性引物和探針，通過交叉試驗(yàn)篩選一對最佳的引物和探針組合。

1.3 病毒核酸的提取 采用Thermo病毒核酸抽提試劑盒在全自動磁珠提取純化系統(tǒng)上提取病毒核酸。陽性對照樣品，先制備PK15細(xì)胞和Marc145單層細(xì)胞，將PCV 2、PCV1、PRV、PPV接種于PK15細(xì)胞，PRRSV接種于Marc145細(xì)胞，每日觀察細(xì)胞病變，待細(xì)胞病變達(dá)75%時(shí)，收獲病毒培養(yǎng)液，提取病毒核酸。具體操作方法參照核酸抽提試劑盒和全自動磁珠提取純化系統(tǒng)說明書進(jìn)行，并用Biodrop超微量核酸蛋白濃度分析儀測定提取的病毒核酸濃度。

1.4 RPA反應(yīng)體系與條件 根據(jù)TwistAmp?exo kit試劑盒提供的反應(yīng)指引進(jìn)行操作，反應(yīng)總體系為50 μL，向含有凍干RPA酶粉的反應(yīng)管中依次加入Rehydration Buffer 29.5 μL、上、下游引物(濃度為10mol/L)各2.1 μL、RPA探針(濃度為10 μmol/L)0.6 μL、樣品DNA 2 μL和DEPC水11.2 μL，充分混勻后再加入2.5 μL MgAc溶液?？焖匐x心混勻后迅速將反應(yīng)管置于等溫?cái)U(kuò)增儀中，40 ℃反應(yīng)5 min，取出離心混合再繼續(xù)反應(yīng)15 min，反應(yīng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測FAM熒光信號。

1.5 特異性試驗(yàn) 為驗(yàn)證建立的RPA方法的特異性，本試驗(yàn)提取了幾種具有相似臨床癥狀的豬病病毒核酸，包括PCV1、PRV、PPV、CSFV、PRRSV等，以這些核酸為模板進(jìn)行RPA反應(yīng)，同時(shí)設(shè)置PCV2核酸為陽性對照，正常健康豬核酸為陰性對照。所有核酸的濃度均為0.5 ng /μL。

1.6 靈敏性和重復(fù)性試驗(yàn) 將提取的PCV2 核酸進(jìn)行10倍比稀釋，各取2 μL為模板進(jìn)行反應(yīng)測定RPA方法的敏感性。同時(shí)用豬圓環(huán)病毒II型核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)進(jìn)行比對，反應(yīng)體系為25 μL；核酸擴(kuò)增反應(yīng)液15 μL、豬圓環(huán)病毒2型反應(yīng)液2 μL、PCR酶混液2 μL、核酸模板 5 μL；反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 3 min；變性95 ℃ 5 s，退火/延伸55 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。另外，每一個(gè)濃度分別用RPA方法重復(fù)檢測6次，分析其檢測穩(wěn)定性。

1.7 臨床樣品檢測 將所采集淋巴結(jié)、脾、肺、腎等組織樣品，用PBS稀釋并研磨成勻漿，反復(fù)凍融3次后，加入蛋白酶K和SDS進(jìn)行消化，4 500 r/min離心15 min，取上清液按照1.3方法提取病毒核酸；所收集的豬血液直接加入蛋白酶K和SDS進(jìn)行消化后，4 500 r/min離心15 min，取上清液按照1.3方法提取核酸。并用本試驗(yàn)建立的RPA恒溫?cái)U(kuò)增方法和國家標(biāo)準(zhǔn)《豬圓環(huán)病毒2型熒光PCR檢測方法》(GB/T 35901-2018)分別對本實(shí)驗(yàn)室收集的183份臨床樣品核酸進(jìn)行檢測，比較兩者的符合性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物和探針 將設(shè)計(jì)合成好的多條上下游引物和探針進(jìn)行交叉組合，按照RPA反應(yīng)體系和條件進(jìn)行RPA反應(yīng)，最終篩選出1對最佳的上下游引物和探針組合(表1)。

表1實(shí)時(shí)熒光RPA方法最佳引物及探針核苷酸序列

名稱序列(5'-3')PCV-FCTACATTTCCAGTAGTTTGTAGTCTCAGCCPCV-RCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGCPCV-PTGATTTCTTTTGTTGTTTGGTTGGAAGTA-ATCAATAGTGGAATCTAGGAC

注：PCV-P探針修飾如下：(1)第31個(gè)堿基修飾BHQ1-dT；(2)第35個(gè)堿基修飾6-FAM-dT； (3)第33個(gè)堿基替換為dSpacer; (4)3'端修飾C3 Spacer

2.2 特異性分析 用PCV1、PRV、PPV、CSFV、PRRSV核酸等為模板，對本試驗(yàn)建立的RPA方法的特異性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，PCV2 核酸為陽性對照出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，其他相關(guān)豬病病毒核酸和陰性對照以及空白對照均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，顯示為陰性，表明本試驗(yàn)建立的PCV2 檢測方法能快速檢測出PCV2核酸，且特異性強(qiáng)，與其他病原體無交叉反應(yīng)(見中插彩版圖1)。

2.3 靈敏性和重復(fù)性分析 提取并測定的PCV2核酸濃度為0.87 ng /μL，將其進(jìn)行10倍比系列稀釋，分別用本試驗(yàn)建立的RPA方法和商品化的PCV2實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒進(jìn)行靈敏性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，本試驗(yàn)建立的RPA方法可檢測出病毒核酸的最大稀釋倍數(shù)為10，對應(yīng)的核酸濃度為0.87×10-4ng / μL；而根據(jù)試劑盒中陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)CT<35，并出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)“S”曲線時(shí)判為陽性，當(dāng)CT≥35時(shí)判為陰性，實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒可檢測出PCV2病毒核酸的最大稀釋倍數(shù)為104，對應(yīng)的核酸濃度為0.87×10-4ng /μL，見中插版圖2、3。由此可見，本試驗(yàn)建立的PCV2病毒核酸RPA檢測方法的靈敏度與商品化的PCV2實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒相當(dāng)。

另外，用建立的RPA方法重復(fù)檢測倍比稀釋后的病毒核酸6次，重復(fù)檢測結(jié)果一致，可檢測病毒核酸的最高稀釋倍數(shù)均為104，說明所建立的PCV2病毒核酸實(shí)時(shí)熒光RPA檢測方法重復(fù)性良好。

3 臨床樣品檢測

提取本實(shí)驗(yàn)室收集的183份臨床樣品核酸，分別用本研究建立的實(shí)時(shí)熒光RPA方法和國家標(biāo)準(zhǔn)《豬圓環(huán)病毒2型熒光PCR檢測方法》(GB/T 35901-2018)進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，兩種方法的符合率為98.9%。

4 討論

PCV2的感染造成豬群免疫力下降，進(jìn)而導(dǎo)致其他多種病原(PRV、PRRSV等)混合感染，生產(chǎn)機(jī)能下降，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。而且，近幾年的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PCV2 陽性率有逐年增長的趨勢[13]。目前，國內(nèi)外主要以熒光PCR技術(shù)作為實(shí)驗(yàn)室的PCV2快速核酸檢測方法。熒光PCR方法具有較高的準(zhǔn)確性和靈敏性，但其檢測時(shí)間長(1 h以上)，需要大型昂貴儀器，因此不適用于基層實(shí)驗(yàn)室或者養(yǎng)豬場的PCV2現(xiàn)場快速篩查。RPA技術(shù)不需要繁瑣的熱循環(huán)，無需變性，恒溫條件下10～15 min即可完成核酸擴(kuò)增，而且靈敏度高，不需要復(fù)雜的樣本處理，可以真正實(shí)現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測。因此，本研究建立的PCV2實(shí)時(shí)熒光RPA技術(shù)為PCV2核酸的快速檢測提供了一種新方法。

實(shí)時(shí)熒光RPA技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)在于引物和探針的設(shè)計(jì)與篩選，RPA引物比一般的PCR引物長，通常需要達(dá)到30～38個(gè)堿基，同時(shí)探針也與熒光PCR的探針不盡相同，除了其兩側(cè)連接dT-熒光基團(tuán)和對應(yīng)的dT-淬滅基團(tuán)之外，中間含有1個(gè)堿基類似物(如dSpacer)；此外，在3′端連接一個(gè)基團(tuán)(如C3-spacer)以防止聚合酶延伸探針。

本試驗(yàn)以PCV2cap基因的保守序列為模板，設(shè)計(jì)出多條引物和探針，通過交叉試驗(yàn)，最終篩選出一組最佳的上下游引物和探針組合。經(jīng)特異性試驗(yàn)證實(shí)，該實(shí)時(shí)熒光RPA方法特異性強(qiáng)，與其他常見的病原體無交叉反應(yīng)。同時(shí)，本試驗(yàn)建立的RPA方法靈敏性高，最低可檢出PCV2核酸濃度為0.87×10-4ng /μL，與商品化的PCV2實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒一致。本試驗(yàn)將所建立的RAP方法進(jìn)行了初步應(yīng)用，共檢測了183份臨床樣品，其結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒檢測結(jié)果高度一致，兩者之間的符合率為98.9%。然而相比熒光PCR反應(yīng)時(shí)長1 h20 min，RPA方法反應(yīng)時(shí)間大大縮短到20 min，僅前者的六分之一。同時(shí)，考慮到實(shí)時(shí)熒光PCR需要大型儀器設(shè)備等因素。因此，本研究建立的PCV2實(shí)時(shí)熒光RPA快速檢測方法作為一種新方法，具有較高的推廣應(yīng)用價(jià)值，適用于我國基層實(shí)驗(yàn)室和養(yǎng)豬場PCV2的快速篩查，為防治乃至根除PCV2提供一定的技術(shù)支持。