川芎提取物對電離輻照損傷實(shí)驗(yàn)小鼠脾臟組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

李 敏，趙 領(lǐng)，劉真宏，羅芳芳,，易輝燕,，趙德華，唐文誠，王繼生,

(1. 西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川 瀘州 646000；2. 綿陽市第三人民醫(yī)院·四川省精神衛(wèi)生中心，四川 綿陽 621000)

川芎(LigusticumChuanxiong)為傘形科藁本屬多年生草本植物，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛等功效[1]。電離輻射致機(jī)體損傷主要產(chǎn)生自由基、活性氧類和促炎細(xì)胞因子/趨化因子，造成DNA、線粒體損傷或細(xì)胞凋亡，使基質(zhì)干細(xì)胞的恢復(fù)及重新繁殖長期受到損害[2]。以往研究表明，川芎提取物能不同程度發(fā)揮對電離輻照損傷小鼠的保護(hù)作用。Ramalingam等[3]在細(xì)胞培養(yǎng)模型中研究發(fā)現(xiàn)，川芎提取物(LigusticumchuanxiongHort. extracts，LCXE)因其強(qiáng)大的供氫能力而具有較強(qiáng)的清除自由基抗氧化能力；Das等[4]研究表明，川芎的主要成分阿魏酸可通過下調(diào)硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)的形成，上調(diào)超氧化物歧化酶及過氧化氫酶活性，從而可預(yù)防輻照誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激；Jeong等[5]從川芎中提取出揮發(fā)油，經(jīng)證實(shí)其具有抗氧化活性，能夠抑制紫外線造成的DNA損傷，減少p21的表達(dá)，增加凋亡調(diào)節(jié)基因cyclineD1的表達(dá)，表明揮發(fā)油具有自由基清除能力，對UVB誘導(dǎo)的DNA損傷和細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抑制作用。而川芎提取物對電離輻射損傷小鼠脾組織細(xì)胞凋亡保護(hù)機(jī)制，未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。

目前研究表明[6]，線粒體通透性轉(zhuǎn)變是細(xì)胞凋亡發(fā)生的先導(dǎo)，Bcl-2家族控制著線粒體外膜和內(nèi)膜的通透性[7]，其中Bcl-2主要分布于線粒體膜和細(xì)胞質(zhì)中，具有拮抗凋亡的作用。Bax分布于細(xì)胞質(zhì)中，具有促凋亡的作用。p53是核內(nèi)的一種磷酸化蛋白質(zhì)，是能夠特異性與DNA序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)DNA損傷，可引起細(xì)胞內(nèi)p53蛋白水平升高，阻斷細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究針對電離輻射誘導(dǎo)線粒體通路細(xì)胞凋亡途徑，研究川芎提取物在該細(xì)胞凋亡信號通路中是否具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 藥物與試劑 川芎提取物，生藥提取率為20 g·L-1，四川同泰植物化工有限公司。氨磷汀(批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20010403)，大連美羅大藥廠。Bcl-2單克隆抗體、Bax單克隆抗體、p53單克隆抗體、DAB顯色試劑盒、免疫組化染色試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒，美國Roche公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 昆明種♂小鼠120只，清潔級，體質(zhì)量(20±2)g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(軍)2012-0011。飼養(yǎng)環(huán)境為晝夜比1 ∶1循環(huán)飼養(yǎng)，保持室內(nèi)濕度 44%～65%，室溫22～26 ℃，給予小鼠正常飲食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過綿陽市第三人民醫(yī)院倫理委員會審核，均遵守實(shí)驗(yàn)動物照料和使用原則。

1.1.3 儀器 TB-718D型包埋機(jī)、TKY-TSI型自動組織脫水機(jī)、TK-218型恒溫攤片烤片機(jī)(湖北泰維科技醫(yī)療有限公司)；BMJ-Ⅲ型病理組織包埋冷凍臺(常州市中威電子儀器有限公司)；HM325型手動輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(Thermo公司)；AX10 imager A2/AX10 cam HRC正置熒光顯微鏡(Zeiss公司)。

1.2方法

1.2.1 動物分組及給藥方法 設(shè)空白組(Normal)、輻照組(ionizing radiation，IR)、氨磷汀組(AMF，腹腔注射260 mg·kg-1)和川芎提取物用藥組(LCXE1、LCXE2、LCXE3，分別灌胃給藥50、100、200 mg·kg-1)。每組20只，輻照前，每天灌胃給藥1次，每次0.5 mL，連續(xù)3 d，d 3給藥后30 min即開始60Co γ射線輻照。

1.2.2 主要試劑溶液配制 10 g·L-1中性甲醛溶液：分別稱取無水磷酸氫二鈉0.65 g、Na2HPO4·2H2O 0.8 g于100 mL燒杯后，加ddH2O 85 mL攪拌至完全溶解，緩慢加入CH3OH 15 mL。

1.2.3 建立電離輻照損傷模型及組織的預(yù)處理 輻照條件：常規(guī)飼養(yǎng)7 d后，采用60Co γ射線全身一次性輻照。輻照條件[8]：5 Gy，輻照率為1.73 Gy·min-1；接受輻照小鼠組別：IR組(陽性對照組)、氨磷汀組、川芎提取物組(50、100、200 mg·kg-1)。小鼠接受輻照后，主要表現(xiàn)為飲水、進(jìn)食相對減少，行動遲緩，嗜睡，皮毛光澤性稍差，呈微凌亂狀態(tài)，偶會有腹瀉，尤其明顯的是，小鼠之間相互靠攏。分別于60Co γ輻照后第72、168 h時摘眼球取血于微量末梢采血管后，用3.5 g·L-1水合氯醛麻醉小鼠，經(jīng)心臟灌注0.9 g·L-1生理鹽水50 mL，取10 g·L-1中性甲醛50 mL經(jīng)心臟灌流固定后，取脾臟組織，并置于10 g·L-1中性甲醛中固定30 min。每組10 只。將固定后的組織分裝于對應(yīng)標(biāo)記的包埋盒，置于自動組織脫水機(jī)中進(jìn)行脫水處理，包埋，3 μm連續(xù)切片。

1.2.4 免疫組化樣品制備與觀察 采用標(biāo)準(zhǔn)免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(streptavidin-perosidase，S-P)染色，加一抗p53(稀釋度 1 ∶150)、Bax(稀釋度 1 ∶200)、Bcl-2(稀釋度 1 ∶100)，具體步驟按S-P法說明書操作，并采用DAB顯色液顯色，中性樹脂封片。結(jié)果判定：p53陽性細(xì)胞為胞核呈黃色，Bax陽性細(xì)胞為胞質(zhì)和(或)胞核呈黃色，Bcl-2陽性細(xì)胞為胞質(zhì)和(或)核膜呈黃色。在每張切片隨機(jī)選取10個400倍視野進(jìn)行圖像分析，各組選取部位一致。陽性細(xì)胞數(shù)越多，反映細(xì)胞內(nèi)蛋白免疫活性(表達(dá)量)越高。

1.2.5 脾臟組織凋亡細(xì)胞的檢測 按TUNEL檢測試劑盒中檢測石蠟切片組織凋亡的說明進(jìn)行。采用正置熒光顯微鏡鏡下觀察，拍照留存，各組選取部位一致。利用Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行圖像的分析處理，主要測量陽性表達(dá)細(xì)胞的平均光密度值。

2 結(jié)果

2.1川芎提取物對實(shí)驗(yàn)小鼠脾組織凋亡細(xì)胞數(shù)目的影響采用TUNEL法檢測的凋亡細(xì)胞核染棕色，以圓形為主，散在三角形或彎月形染色，總體呈散在分布，正常細(xì)胞核染藍(lán)色，實(shí)驗(yàn)以陽性細(xì)胞數(shù)目來衡量DNA受損程度?？瞻捉M僅見極少散在的凋亡細(xì)胞。與空白組比，IR、LCXE1、LCXE2、LCXE3、AMF組的小鼠脾組織凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加，差異具有顯著性(P<0.05)，且IR組顯著性最強(qiáng)(P<0.01)，說明輻照后小鼠脾臟組織細(xì)胞凋亡的發(fā)生較為明顯。分別于小鼠接受60Co γ射線輻照后72、168 h觀察發(fā)現(xiàn)，與IR組比較，LCXE1、LCXE2、AMF組小鼠脾組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量均明顯減少(P<0.01)，且兩觀察點(diǎn)的LCXE1、LCXE2、LCXE3組小鼠脾組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量隨用藥劑量的增加而增加。除空白組外，隨輻照后觀察時間的推移，各組小鼠脾臟凋亡細(xì)胞數(shù)量均大幅度增加，見Tab 1、Fig 1。

Tab 1 TUNEL staining results of LCXEon apoptosis in splenic tissues of experimental mice n=10)

##P<0.01vsnormal group;*P<0.05,**P<0.01vsIR group

2.2川芎提取物對實(shí)驗(yàn)小鼠脾組織Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig 2、Tab 2結(jié)果顯示，正常組僅見極少散在的Bcl-2蛋白陽性染色。隨輻照后觀察時間的推移，各組小鼠脾臟組織Bcl-2蛋白表達(dá)量均有所增加。與IR組比，輻照后72 h，AMF、LCXE2、LCXE3組小鼠脾組織Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與IR組比，輻照后168 h，AMF、LCXE2、LCXE3組小鼠脾組織Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)。

2.3川芎提取物對實(shí)驗(yàn)小鼠脾組織Bax蛋白表達(dá)的影響在小鼠脾臟切片中，Bax陽性表達(dá)表現(xiàn)為胞質(zhì)棕黃色深染。空白組未見Bax陽性表達(dá)，IR組在輻照后72 h時已觀察到Bax的陽性表達(dá)，隨輻照后時間的推移，Bax陽性表達(dá)增強(qiáng)，到168 h時表達(dá)明顯高于72 h。與IR組比，輻照后72 h時，AMF、LCXE3組小鼠脾組織Bax蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，LCXE2組小鼠脾組織Bax蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)；與IR組比，輻照后168 h時，AMF組小鼠脾組織Bax蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，LCXE2、LCXE3組降低(P<0.05)，見Tab 2、Fig 3。2.4川芎提取物對實(shí)驗(yàn)小鼠脾組織p53蛋白表達(dá)的影響在小鼠脾臟組織切片中，空白組見散在少量p53核染陽性表達(dá)。比較輻照后72 h和168 h時各組p53蛋白表達(dá)量，隨輻照后時間的推移，p53蛋白表達(dá)增加，168 h時各組脾組織的p53表達(dá)明顯高于72 h；與IR組比，AMF、LCXE2、LCXE3組小鼠脾組織p53蛋白表達(dá)量在輻照后72、168 h兩個時間點(diǎn)均明顯降低(P<0.01)，見Tab 2、Fig 4。

Fig 1 Effect of LCXE on the splenic tissue of ionizing radiated mice on the 72nd and 168th hour observed by TUNEL staining (×400)

Fig 2 Expression of Bcl-2 protein in the splenic tissue of ionizing radiated mice at the 72nd and 168th hour(×400)

Fig 3 Expression of Bax protein in the splenic tissue of ionizing radiated mice at the 72nd and 168th hour (×400)

Fig 4 Expression of p53 protein in the splenic tissue of ionizing radiated mice at the 72nd and 168th hour (×400)

GroupDose/mg·kg-1Bcl-2 (OD)72 h168 hBax (OD)72 h168 hp53 (OD)72 h168 hNormal-0.09±0.020.08±0.030.07±0.010.08±0.040.06±0.030.05±0.05IR-0.16±0.05##0.27±0.11##0.32±0.09##0.52±0.13##0.42±0.09##0.63±0.13##AMF2600.41±0.12??0.51±0.17??0.16±0.08??0.31±0.12??0.28±0.10??0.45±0.17??LCXE1500.24±0.080.34±0.13?0.34±0.100.44±0.090.44±0.050.58±0.19LCXE21000.30±0.14??0.48±0.19??0.25±0.08?0.45±0.15?0.31±0.12??0.42±0.14??LCXE32000.33±0.08??0.45±0.12??0.24±0.10??0.41±0.12?0.30±0.11??0.40±0.11??

##P<0.01vsnormal;*P<0.05,**P<0.01vsIR

3 討論

Lomax等[9]研究發(fā)現(xiàn)，電離輻照致機(jī)體損傷與DNA有關(guān)，當(dāng)DNA損傷或營養(yǎng)缺乏等刺激時，易致MDM2基因抑制，其下游多條信號通路被激活，使得p53蛋白水平明顯升高。而p53可上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。本研究采用小鼠60Co γ輻照方法制備小鼠輻照損傷模型，免疫組化法觀察川芎提取物對電離輻照損傷小鼠脾臟組織凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、p53表達(dá)的影響，TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡，以探討川芎提取物對電離輻照損傷的保護(hù)機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，凋亡相關(guān)蛋白在正常小鼠脾臟組織中幾乎沒有表達(dá)，但在電離輻照損傷后，Bcl-2、p53、Bax蛋白則出現(xiàn)表達(dá)?？沟蛲龅鞍譈cl-2的過度表達(dá)可以阻止p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在不同時間點(diǎn)觀察發(fā)現(xiàn)，與IR組相比，AMF、LCXE2、LCXE3組小鼠脾組織Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯增加，而p53蛋白表達(dá)量均明顯降低。說明川芎提取物可能通過上調(diào)Bcl-2蛋白，下調(diào)p53蛋白的表達(dá)，具有抗輻照損傷作用。不過值得注意的是，雖然p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑中的Bcl-2蛋白表達(dá)增加，但細(xì)胞周期阻滯仍然發(fā)生，表明Bcl-2不直接阻斷p53所有功能。因此，Bcl-2(或其他促生存Bcl-2家族成員)是在細(xì)胞凋亡信號中下游點(diǎn)，抑制p53誘導(dǎo)的凋亡[11]。在Bcl-2調(diào)節(jié)的細(xì)胞凋亡途徑中，有兩種蛋白受p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)控：促凋亡效應(yīng)分子Bax和Apaf-1(caspase-9激活的支架蛋白)[12]。本研究中，川芎提取物各劑量組輻照損傷小鼠的脾臟組織中Bax、p53蛋白表達(dá)均明顯低于輻照組。表明川芎提取物可能通過下調(diào)Bax、p53蛋白的表達(dá)，從而對電離輻照損傷起到一定的保護(hù)作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，川芎提取物對電離輻照損傷小鼠的脾臟組織具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制較為復(fù)雜，本文僅從線粒體凋亡通路闡述川芎提取物對電離輻射損傷的保護(hù)作用，這種保護(hù)作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究進(jìn)行證實(shí)和補(bǔ)充。另外，川芎提取物在電離輻射損傷小鼠的其他細(xì)胞凋亡通路的調(diào)控仍需進(jìn)一步研究。

(致謝：感謝中國工程物理研究院核物理與化學(xué)研究所的朱莎老師對動物造模提供幫助，感謝綿陽市第三人民醫(yī)院病理科的宋大萍、江葉、袁華、郭敬萍、曾淋老師給予病理技術(shù)支持與指導(dǎo)，感謝王蕾、徐敬文、王小紅、歐陽敏、曹莉莎、羅文、郭濠寧、吳思霖在動物實(shí)驗(yàn)中給予支持與幫助。)