苦參堿對大鼠乳腺癌細(xì)胞荷瘤生長及其炎性因子與免疫功能的影響*

張瑞奎， 汪 超

(武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤外科, 天津 300162)

乳腺癌位居女性惡性腫瘤發(fā)病率、病死率的第一位。據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)預(yù)測，2015～2035年乳腺癌新發(fā)病例亦將呈現(xiàn)逐年增加態(tài)勢，并呈現(xiàn)年輕化趨勢。臨床上，中藥制劑能夠顯著改善癌癥的有效性指標(biāo)，提高癌癥患者的生活質(zhì)量，降低毒副作用發(fā)生率?？鄥A是存在于苦參根部的生物堿，具有抗炎、抗過敏、抗病毒、抗心室重構(gòu)、抗腫瘤作用[1-2]。腫瘤病人免疫功能低下，炎性因子也影響著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3]。荷瘤，指機體有腫瘤，移植瘤是荷瘤的一種，鼠是常用的荷瘤動物。本實驗采用乳腺癌細(xì)胞荷瘤大鼠模型，研究苦參堿對腫瘤的抑制作用、觀察血液中相關(guān)炎性因子的變化，探討苦參堿對細(xì)胞免疫和體液免疫的影響，以期為苦參堿的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及乳腺癌瘤株

SPF級雌性Wistar大鼠，體質(zhì)量(180-200) g 60只，體質(zhì)量100 g 3只，購自北京維通利華實驗動物中心。乳腺癌(Walker256)瘤株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 實驗藥品

苦參堿由大連美侖生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；香菇多糖片由浙江普洛康浴天然藥物有限公司生產(chǎn)。

1.3 實驗試劑與儀器

大鼠IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-10、TGF-β ELISA試劑盒購自上海朗頓生物技術(shù)有限公司；電子天平(BSA124S-CW，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；酶標(biāo)儀(BMG FLUOstar Omega, LRBTECH公司)。

1.4 乳腺癌細(xì)胞荷瘤大鼠模型[4]的建立

凍存的乳腺癌細(xì)胞株Walker256復(fù)蘇后，以細(xì)胞培養(yǎng)用PBS液調(diào)整細(xì)胞密度至2×107cells/ml，3只100 g大鼠各用無菌注射器腹腔注射細(xì)胞懸液1 ml接種。7 d后抽取大鼠腹水，800 r/min離心5 min，用PBS液調(diào)整細(xì)胞密度為5×107cells/ml，取0.4 ml細(xì)胞懸液接種于Wistar大鼠右腋皮下。觀察大鼠一般情況，發(fā)現(xiàn)接種4 d后大鼠體重明顯減輕，攝食量明顯減少，活動量明顯減少，毛發(fā)無光澤等體征，大鼠右腋皮下可觸及黃豆大小的腫塊，表明大鼠乳腺癌細(xì)胞荷瘤模型成功建立。

1.5 分組及給藥

60只成年Wistar大鼠，隨機分為對照組(n=10)和乳腺癌細(xì)胞荷瘤大鼠建模組(n=50)。建模后，50只大鼠再隨機分為5組(n=10)：模型組，香菇多糖(200 mg/kg)組，苦參堿低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高(200 mg/kg)劑量組，按給藥劑量及給藥體積(10 ml/kg)，用蒸餾水將苦參堿和香菇多糖配成懸液。造模當(dāng)天，香菇多糖組和苦參堿低、中、高劑量組大鼠腹腔注射給藥，2次/d，連續(xù)14 d；對照組和模型組腹腔注射相應(yīng)體積的蒸餾水。末次給藥前禁食12 h，給藥后1 h腹腔注射2%戊巴比妥鈉 (60 mg/kg)麻醉。固定大鼠后打開腹腔，經(jīng)腹主動脈采血6 ml，然后處死大鼠，分離大鼠腋下乳腺癌腫塊組織。

1.6 ELISA檢測血清炎性因子

分離3 ml腹主動脈采集血液的血清，用于檢測血清中IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-10及TGF-β水平，實驗步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，終止反應(yīng)后，使用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度值。

1.7 細(xì)胞免疫、體液免疫指標(biāo)檢測

腹主動脈采集的另3 ml血液使用淋巴細(xì)胞分離液分離有核細(xì)胞。有核細(xì)胞經(jīng)染色30 min后，棄去上清液，沖洗2次，流式細(xì)胞儀檢測外周血T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+的水平。采用免疫散射比濁法檢測免疫球蛋白IgG、IgM、IgA水平。

1.8 抑瘤率的計算

用電子天平精確稱量分離所得的瘤組織質(zhì)量并計算抑瘤率，抑瘤率=(模型組平均瘤質(zhì)量-用藥組平均瘤質(zhì)量)/模型組平均瘤質(zhì)量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 苦參堿對荷瘤大鼠腫瘤生長的影響

對照組無瘤塊。模型組瘤塊較大，平均質(zhì)量為(6.62±1.20) g。與模型組比較，香菇多糖組和苦參堿低、中、高劑量組瘤塊平均質(zhì)量分別為(4.77±0.95) g、(4.99±0.93) g、(4.52±0.92) g、(4.22±1.18) g，均明顯減輕，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與香菇多糖組比較，苦參堿低、中、高劑量組瘤塊平均質(zhì)量均無明顯差異(P>0.05)；香菇多糖組和苦參堿低、中、高劑量組的抑瘤率分別為27.9%、24.6%、31.7%、36.3%，四組之間無統(tǒng)計學(xué)差異，苦參堿低、中、高劑量組呈現(xiàn)出劑量依賴性抑制腫瘤生長的趨勢(表1)。

GroupTumor weight(g)Inhibitory rate(%)Vehicle6.62±1.20 -Lentinan4.77±0.95**27.9Matrine (low dose)4.99±0.93**24.6Matrine (middle dose)4.52±0.92**31.7Matrine (high dose)4.22±1.18**36.3

**P<0.01vsvehicle group

2.2 苦參堿對荷瘤大鼠外周血IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-10和TGF-β水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠外周血IL-2、IFN-γ水平均明顯降低(P<0.01)，IL-6、IL-10和TGF-β水平均明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，香菇多糖組和苦參堿低、中、高劑量組大鼠外周血IL-2、IFN-γ水平明顯升高(P<0.01)；IL-6、IL-10和TGF-β水平均明顯降低(P<0.01，P<0.05)；苦參堿低、中、高劑量組呈現(xiàn)出劑量依賴性作用的趨勢。與香菇多糖組比較，苦參堿高劑量組大鼠外周血IL-2和IFN-γ水平明顯升高(P<0.01)，低劑量組IFN-γ水平明顯降低(P<0.05)；高劑量組IL-10水平明顯降低(P<0.05，表2-3)。

GroupIL-2IFN-γControl222.6±10.6271.4±9.7Vehicle145.6±7.5**202.7±17.0**Lentinan174.2±9.9##235.9±13.6##Matrine (low dose)170.2±11.7##224.6±10.0##ΔMatrine (middle dose)182.9±12.7##232.5±8.6##Matrine (high dose)189.8±12.6##ΔΔ253.1±10.7##ΔΔ

IL-2: Interleukin 2; IFN-γ: Interferon -γ

**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsvehicle group;ΔP<0.05,ΔΔP<0.01vslentinan group

Group IL-6 IL-10TGF-βControl41.4±4.846.9±6.3141.3±11.3Vehicle102.6±6.1**91.8±14.2**228.7±9.5**Lentinan74.7±6.3##78.9±10.9#190.4±13.5##Matrine (low dose)81.5±8.1##80.1±7.5#202.1±15.7##Matrine (middle dose)77.1±9.2##74.3±7.2##188.0±11.8##Matrine (high dose)71.3±7.0##70.0±5.4##Δ180.4±11.0##

IL-6: Interleukin-6; IL-10: Interleukin-10; TGF-β: Transforming growth factor-β

**P<0.01vscontrol group；#P<0.05,##P<0.01vsvehicle group;ΔP<0.05vslentinan group

2.3 苦參堿對荷瘤大鼠細(xì)胞免疫和體液免疫指標(biāo)的影響

與對照組比較，模型組大鼠外周血CD3+、CD4+、IgG、IgM、IgA水平均明顯升高(P<0.01)，CD8+水平明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，香菇多糖組和苦參堿低、中、高劑量組大鼠外周血CD3+、CD4+、IgG、IgM、IgA水平明顯降低(P<0.01，P<0.05)；CD8+水平均明顯升高(P<0.01，P<0.05)，苦參堿低、中、高劑量組呈現(xiàn)出劑量依賴性作用的趨勢。與香菇多糖組比較，苦參堿高劑量組大鼠外周血CD4+水平明顯降低(P<0.01)；低、中劑量組大鼠外周血IgM、IgA和高劑量組IgA水平明顯升高(P<0.01，P<0.05，表4-5)。

Group CD3+ CD4+CD8+Control38.1±4.626.1±4.423.5±3.5Vehicle62.3±6.7**45.7±4.4**17.6±3.5**Lentinan45.3±5.7##36.4±3.7##22.7±4.4#Matrine (low dose)54.3±4.6##ΔΔ38.7±3.3##21.0±3.4#Matrine (middle dose)48.8±6.5##36.2±3.4##21.6±3.0##Matrine (high dose)46.4±5.1##30.6±2.6##ΔΔ23.1±1.9##

**P<0.01vscontrol group；#P<0.05,##P<0.01vsvehicle group;ΔΔP<0.01vslentinan group

Group IgG IgMIgAControl10.64±2.921.43±0.171.13±0.14Vehicle15.28±2.51**2.08±0.13**2.63±0.18**Lentinan11.65±2.28##1.64±0.11##1.70±0.33##Matrine (low dose)12.84±1.11#1.93±0.17#ΔΔ2.38±0.22#ΔΔMatrine (middle dose)11.86±2.02##1.75±0.12##Δ2.12±0.15##ΔΔMatrine (high dose)11.74±1.57##1.67±0.10##2.02±0.24##Δ

**P<0.01vscontrol group；#P<0.05,##P<0.01vsvehicle group;ΔP<0.05,ΔΔP<0.01vslentinan group

3 討論

中藥苦參堿具有抑制腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗炎鎮(zhèn)痛等功能。本實驗通過建立乳腺癌細(xì)胞荷瘤大鼠模型，觀察苦參堿對大鼠乳腺癌細(xì)胞荷瘤生長及其炎性因子與免疫功能的影響。

腫瘤免疫分為免疫清除、免疫平衡和免疫逃逸三個階段[5-6]。在免疫清除期，免疫系統(tǒng)可以抑制腫瘤的生長，起到免疫清除作用，其中IFN-γ、IL-2等起到重要作用。在免疫平衡期，腫瘤細(xì)胞獲得新的免疫特性，誘導(dǎo)IL-6、IL-10、TGF-β等炎性因子過度產(chǎn)生，在腫瘤細(xì)胞周圍形成免疫抑制的微環(huán)境[7]。在免疫逃逸期，免疫系統(tǒng)反而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[8]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠外周血IL-2、IFN-γ水平較對照組明顯降低，IL-6、IL-10、TGF-β水平較對照組明顯升高；苦參堿低、中、高劑量組能明顯逆轉(zhuǎn)這種變化，糾正荷瘤大鼠體內(nèi)炎性因子的紊亂，并且呈現(xiàn)出劑量依賴性作用的趨勢。

腫瘤可使機體的細(xì)胞免疫和體液免疫發(fā)生異常改變。細(xì)胞免疫主要表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞亞群的改變，包括CD3+、CD4+水平明顯升高和CD8+水平明顯降低[9]。體液免疫方面表現(xiàn)為由B淋巴細(xì)胞分泌的免疫球蛋白IgG、IgM、IgA含量明顯升高[10]。經(jīng)苦參堿低、中、高劑量治療后，可使血清CD3+、CD4+水平明顯降低、CD8+水平明顯升高；可使血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA含量明顯降低，并且呈現(xiàn)出劑量依賴性作用的趨勢。

在實驗性乳腺癌細(xì)胞荷瘤大鼠模型上，苦參堿在抑制瘤塊生長、糾正炎性因子紊亂、調(diào)節(jié)免疫功能異常方面的療效與目前廣泛應(yīng)用于臨床的香菇多糖沒有明顯差異性，說明苦參堿具有很大的開發(fā)利用價值。