紅景天苷對大鼠腦組織及動脈血熱休克蛋白的影響Δ

涂志蘭，葉 敏，王志娥，金芃芃，王清華，葉 軍，宿 映，楊化蘭，李清華，肖偉忠，侯雙興#

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 201399； 2.復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院普外科，上海 201399； 3.復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，上海 201399； 4.復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院科創(chuàng)中心，上海 201399)

腦卒中是全球人口死亡和殘疾的主要原因，其發(fā)病機制非常復(fù)雜[1]，而缺血性腦卒中為其最常見的類型，約占全部腦卒中的87%[2]。紅景天苷是紅景天根和根莖中的主要活性成分，具有抗疲勞、抗炎、抗自由基損傷、抗細胞凋亡及增強免疫功能等多種藥理作用[3]。最新研究結(jié)果表明，紅景天苷可改善內(nèi)皮損傷，減輕動脈硬化程度，對急性腦缺血損傷具有顯著的神經(jīng)保護功能，而體外研究結(jié)果顯示紅景天具有很強的抗氧化活性[4-5]。但目前紅景天苷對急性缺血性腦卒中神經(jīng)保護作用的具體機制尚不清楚。熱休克蛋白(HSP)是在高熱、缺氧等應(yīng)激條件下產(chǎn)生的一類應(yīng)激反應(yīng)性蛋白，其中與急性缺血性腦卒中關(guān)系最為密切的是HSP70，其在缺血缺氧應(yīng)激后表達程度最高。本研究通過將紅景天苷預(yù)處理后進行大鼠大腦動脈自體血栓栓塞，建立急性缺血性腦卒中模型，觀察大鼠腦組織及動脈血HSP70表達量的變化，以探討紅景天苷預(yù)處理后HSP70在急性缺血性腦損傷中腦組織及腦微血管內(nèi)皮細胞內(nèi)表達量的差異。

1 材料

1.1 動物

SD大鼠24只，體質(zhì)量300～400 g，鼠齡12～13個月，雄性為主，由上海市浦東醫(yī)院動物飼養(yǎng)中心提供。

1.2 試驗用具

不同型號的PE管，長約4 cm，包括：內(nèi)徑×外徑=1.0 mm×0.5 mm，內(nèi)徑×外徑=0.50 mm×0.25 mm，內(nèi)徑×外徑=0.61 mm×0.28 mm；22G寵物專用輸液留置針；不同型號注射器(1 ml、5 ml)若干。

2 方法

2.1 分組

將SD大鼠24只隨機分為對照組(C組)、自體血栓栓塞組(Z組)及自體血栓栓塞+紅景天苷組(HZ組)，每組8只。

2.2 紅景天苷預(yù)處理

紅景天苷臨用前以雙蒸水溶解為5 g/L(平均1 ml中含紅景天苷5 mg)。HZ組大鼠腹腔注射紅景天苷24 mg/(kg·d)，連續(xù)注射6 d；C組、Z組大鼠腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)注射6 d。第7日取Z組、HZ組大鼠制作大腦中動脈自體血栓栓塞模型。

2.3 大鼠大腦中動脈自體血栓栓塞模型的建立

(1)血栓制作過程：取Z組、HZ組大鼠，腹腔內(nèi)注射0.4%戊巴比妥10 ml/kg，麻醉后將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上，保持室內(nèi)溫度20～25 ℃。術(shù)中注意動物呼吸并保持呼吸道通暢，左側(cè)頸正中切口，尋找頸總動脈，將頸總動脈近心端結(jié)扎，結(jié)扎線提起頸總動脈，將1 ml針筒的末端連接4 cm的PE管，用眼科剪將頸總動脈剪一小口，將1 ml針筒的末端連接4 cm的PE管(規(guī)格：內(nèi)徑*外徑=1.0 mm*0.5 mm，北京西濃科技有限公司)導(dǎo)流出動脈血，使4 cm的PE管內(nèi)充滿動脈血(約0.2 ml)后結(jié)扎線上提阻斷血液，將內(nèi)有動脈血的PE管放置于40～60 ℃左右的水面上靜置30～40 min，然后將導(dǎo)管內(nèi)的血凝塊用注射器緩緩移入0.9%氯化鈉溶液中，清洗2～3遍去掉血栓表面的紅細胞。(2)大鼠大腦中動脈栓塞模型的制作：用4 cm的PE管設(shè)計留置導(dǎo)管：將22G寵物專用輸液留置針末端連接至總長4 cm的PE管(規(guī)格：內(nèi)徑×外徑=0.50 mm×0.25 mm，北京西濃科技有限公司)上，PE管末端2 cm處進行標(biāo)記，用該設(shè)計的留置導(dǎo)管吸取上述凝縮后約2 cm的血栓，在該頸總動脈開口前，后各放1根手術(shù)線，打活結(jié)，將該設(shè)計的留置導(dǎo)管在剪開的頸總動脈剪開的開口處插入，插入后1根結(jié)扎線系緊，尋找頸內(nèi)動脈后，沿頸內(nèi)動脈方向，利用眼科鑷將該PE管緩慢輕推帶有血栓的PE管至遇輕微阻力后阻塞大腦中動脈起始處，松開另1根結(jié)扎線，緩緩將PE管內(nèi)的血栓注入大腦中動脈后將PE管緩慢推出后立即將開口處用結(jié)扎法扎緊，進行縫合，縫好后用酒精棉球消毒皮膚縫合處。術(shù)中及麻醉期間以小電熱毯維持大鼠直腸溫度36.5～37 ℃，注意觀察大鼠呼吸及心率變化。建模成功表現(xiàn)為：大鼠左前肢持續(xù)屈曲，提尾實驗陽性；側(cè)推抵抗力減弱，轉(zhuǎn)圈試驗陽性。

2.4 建模2 h后操作

2.4.1 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法檢測腦梗死體積：Z組、HZ組大鼠按“2.3”項下方法栓塞2 h后處死大鼠，斷頭取腦后以視交叉為中心，取厚腦片2 mm，放入液氮中冷凍2 min后取出，放入2%的TTC溶液中，置于37 ℃溫水浴30 min染色，正常組織染為紅色，梗死組織呈白色。然后將腦片放入4%多聚甲醛中固定，1 d后測梗死體積以排除梗死組織不同程度水腫的影響。采用Image ProPlus 6.0圖像分析軟件測出各層梗死面積、總面積之和，計算公式為腦梗死體積比例=(各切面梗死面積之和)/(各切面面積之和)[6]。

2.4.2 檢測HSP70蛋白的表達：Z組、HZ組大鼠建模2 h后留取動脈血，收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測HSP70蛋白的表達。

2.4.3 腦組織及腦微血管內(nèi)皮細胞HSP70的表達量：Z組、HZ組大鼠斷頭取腦后，取左側(cè)腦組織，采用Western Blot法檢測HSP70在腦組織中的表達。同時在左側(cè)大腦皮層獲取腦組織內(nèi)微血管，收集腦組織微血管內(nèi)皮細胞進行細胞分層，采用Western Blot法檢測HSP70在血管內(nèi)皮細胞中蛋白表達，提取大鼠腦組織總蛋白，計算蛋白含量。安裝垂直電泳儀，配置10%的SDS分離膠及濃縮膠。取樣本變性、冰浴，離心后上樣。電泳后組裝濕式轉(zhuǎn)印夾層，恒壓轉(zhuǎn)移蛋白1.5 h，取出轉(zhuǎn)印膜，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白條帶定位目的基因，經(jīng)5%脫脂牛奶封閉室溫(25 ℃)1 h，一抗4度孵育過夜、二抗室溫1 h孵育，顯影觀察，應(yīng)用圖像分析軟件進行條帶的灰度測定。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 三組大鼠TTC染色結(jié)果比較

與C組比較，Z組大鼠的腦梗死面積極明顯增大，差異有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；HZ組大鼠腦梗死體積明顯增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而HZ組與Z組大鼠腦梗死體積的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1—2。提示模型成功，紅景天苷預(yù)處理對大鼠大腦中動脈自體血栓栓塞模型的腦缺血損傷有減輕作用。

圖1 TTC染色結(jié)果Fig 1 Staining results of TTC

3.2 三組大鼠動脈血HSP70表達量比較

與C組比較，Z組大鼠動脈血HSP70表達量明顯增多，差異有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而HZ組大鼠動脈血HSP70表達量極明顯增多，差異有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1)；與Z組相比，HZ組大鼠動脈血HSP70表達量明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。表明Z組、HZ組大鼠不同程度的應(yīng)激導(dǎo)致了動脈血HSP70表達量的增加。

圖2 三組大鼠切面梗死面積與切面面積的比Fig 2 Ratio of the infarcted area to the cut area among three groups of rats

圖3 三組大鼠動脈血HSP70表達量比較Fig 3 Comparison of HSP70 expression in arterial blood among three groups of rats

3.3 Western Blot法檢測三組大鼠腦組織與腦微血管內(nèi)皮細胞HSP70表達量變化情況

與Z組比較，HZ組大鼠自體血栓栓塞側(cè)腦組織HSP70表達量明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與C組比較，HZ組大鼠自體血栓栓塞側(cè)腦微血管內(nèi)皮細胞HSP70表達量明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4—5。

圖4 三組大鼠自體血栓栓塞側(cè)腦組織HSP70表達量Fig 4 Expression of HSP70 in brain tissue of autologous thromboembolism among three groups of rats

圖5 三組大鼠自體血栓栓塞側(cè)腦微血管內(nèi)皮細胞HSP70表達量Fig 5 Expression of HSP70 in lateral cerebral microvascular endothelial cells of autologous thromboembolismamong three groups of rats

4 討論

文獻報道，在高原上生存的生物中，有的依靠增加血紅蛋白水平來適應(yīng)低氧環(huán)境，還有的通過改善血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能增加對氧的親和度[7]。紅景天素有“高原人參”之稱，著名藏醫(yī)經(jīng)典《四部醫(yī)典》中記載紅景天藥理作用廣泛，其具有增強心腦耐缺氧、抗炎等的作用，還可抗疲勞、抗寒冷、提高免疫功能、抑制缺血再灌注損傷引起的脂質(zhì)過氧化及清除自由基等[8]。研究結(jié)果提示，紅景天苷可通過磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶/缺氧誘導(dǎo)因子(PI3K/Akt/HIF)信號通路抑制炎癥反應(yīng)，減輕腦缺血性損傷；并可通過延長腦卒中的治療時間窗而發(fā)揮神經(jīng)保護作用；雖然目前紅景天苷的神經(jīng)保護作用已被廣泛報道，但其具體作用機制、由何種相關(guān)蛋白參與及主要通過何種通路發(fā)揮作用尚不清楚[9]。

多項試驗結(jié)果均提示，HSP70作為最重要的內(nèi)源性熱休克蛋白，在減輕應(yīng)激損傷、維持細胞穩(wěn)態(tài)、恢復(fù)細胞功能及減輕炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要的作用[10-12]。研究結(jié)果顯示，HSP70對神經(jīng)細胞的凋亡及壞死有抑制作用[13]，但HSP70應(yīng)激性表達增加能否拮抗神經(jīng)細胞的氧化應(yīng)激及其分子機制目前尚無直接的研究報道，如能發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)HSP70表達的化合物，其在臨床治療上將有廣闊的應(yīng)用前景。

前期研究中，通過對由高脂血癥引起的兔顱內(nèi)外不同腦動脈硬化的蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，相同實驗條件下，顱內(nèi)動脈硬化程度比顱外動脈硬化程度輕[14]；通過對顱內(nèi)外不同硬化動脈進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了8種差異蛋白表達，對其中的HSP70進一步分析發(fā)現(xiàn)，其在顱內(nèi)動脈表達量高于顱外動脈，推測動脈硬化程度可能與HSP70的神經(jīng)保護作用相關(guān)[15]，但未進行深入探討。目前，西方醫(yī)學(xué)尚無確切的治療手段針對動脈粥樣硬化的進展。一些中藥制劑對延緩動脈粥樣硬化性疾病的進展具有確切的療效，但具體作用機制尚不明確。挖掘中藥中具有誘導(dǎo)HSP70高表達的有效成分并闡明其分子作用機制，可為開發(fā)治療腦缺血的新藥提供理論基礎(chǔ)[13]。本研究結(jié)果顯示，與Z組比較，HZ組大鼠自體血栓栓塞側(cè)腦組織HSP70表達量明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與C組比較，HZ組大鼠自體血栓栓塞側(cè)腦微血管內(nèi)皮細胞HSP70表達量明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；提示紅景天苷可有效誘導(dǎo)HSP70的表達。

本研究首先檢驗了紅景天苷預(yù)處理是否能增強缺血性腦卒中大鼠的耐受性，其次明確了HSP70在大鼠自體血栓栓塞模型中發(fā)揮的潛在角色，發(fā)現(xiàn)HSP70在預(yù)防缺血性腦卒中病情的進一步進展中能發(fā)揮關(guān)鍵性作用。TTC染色結(jié)果提示，與C組比較，Z組大鼠的腦梗死面積極明顯增大，差異有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；HZ組大鼠腦梗死體積明顯增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，模型成功；提示紅景天苷預(yù)處理對大鼠大腦中動脈自體血栓栓塞模型的腦缺血損傷有減輕作用，與Han[16]的結(jié)果相似。而Han[16]的研究結(jié)果表明，大鼠經(jīng)過紅景天苷預(yù)處理可減輕腦缺血再灌注損傷，可能與降低血-腦脊液屏障通透性、減輕腦水腫及降低腫瘤壞死因子α的表達有關(guān)。但本研究結(jié)果提示，紅景天苷預(yù)處理可使HSP70表達量增加，至于通過何種機制及通路發(fā)揮作用，還需進一步研究。