OTX2基因表達(dá)下調(diào)對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖分化和自噬的影響

田玉樓，于默，史婭婕，張薇

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸教研室，沈陽(yáng) 110002）

骨性反牙合是臨床中常見的錯(cuò)牙合畸形，下頜骨發(fā)育過(guò)度是其主要發(fā)病機(jī)制，目前雖尚未有明確的易感基因，但口腔頜面發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)水平的變化會(huì)影響其發(fā)生。OTX2屬于鄰位齒狀同源盒 （orthodentielehomeo-box，OTX） 基因家族的一員，在顱面和腦前結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)發(fā)育中起關(guān)鍵作用，參與第一鰓弓和第二鰓弓的形成。OTX基因家族是骨性反牙合的候選基因，參與調(diào)控下頜骨的生長(zhǎng)發(fā)育［1］。OTX2基因的缺失可能引起口腔、下頜骨、脊椎等的發(fā)育缺陷，引發(fā)眼-耳-脊椎綜合征［2］。

自噬是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的高度保守的過(guò)程，是骨形成和發(fā)育過(guò)程中不可缺少的調(diào)節(jié)因子［3-4］。自噬可增強(qiáng)顱頜面骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和抗凋亡能力，調(diào)控其向成骨細(xì)胞分化［5-6］，還可以幫助處于應(yīng)激條件下的成骨細(xì)胞抵御環(huán)境變化，維持其增殖和正常生理功能［7］。通過(guò)抑制成骨細(xì)胞自噬水平可以抑制該細(xì)胞增殖［8］，提示自噬與成骨細(xì)胞的形成和細(xì)胞增殖有密切關(guān)系，降低成骨細(xì)胞的自噬水平可以引起成骨細(xì)胞的增殖減少。

本研究應(yīng)用小干擾RNA （small inteference RNA，siRNA）技術(shù)下調(diào)小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1中OTX2的表達(dá)水平，檢測(cè)其對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化的影響，觀察自噬水平的改變，為闡明骨性反牙合的分子遺傳機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

α MEM培養(yǎng)基 （美國(guó)Hyclone公司） ，胎牛血清 （美國(guó)CLARK公司） ，抗OTX2抗體 （英國(guó)Abcam公司） ，siRNA-mate轉(zhuǎn)染試劑和化學(xué)合成的OTX2-siRNA （蘇州吉瑪公司） ，SABC試劑盒及DAB顯色試劑 （武漢博士德公司） ，堿性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP） 測(cè)試盒 （南京建成生物工程研究所） ，MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、自噬染色檢測(cè)試劑盒 （MDC法） 均購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)，在含10%胎牛血清、1%雙抗 的α MEM中 于37 ℃、5%CO2培 養(yǎng) 箱 中 培 養(yǎng)。3～4 d傳代1 次，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)為對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。設(shè)計(jì)3對(duì)靶向的OTX2-siRNA序列，用于轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞系。OTX2-siRNA合成序列如下，OTX2-mus-868，5’-GCAGUGCUCCAGUGUCUAU TT-3’，5’-AUAGACACUGGAGCACUGCTT-3’；OTX2-mus-1027，5’-GCAUGGACUGUGGAUCUUAT T-3’，5’-UAAGAUCCACAGUCCAUGCTT-3’；OTX2-mus-1225，5’-CCUCUUGGAAGCUUAACUUTT-3’，5’-AAGUUAAGCUUCCAAGAGGTT-3’；陰 性 對(duì) 照siRNA，5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。 將MC3T3-E1細(xì)胞隨機(jī)分為OTX2-mus-868組、OTX2-mus-1027組、OTX2-mus-1225組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組。將MC3T3-E1接種在無(wú)菌6孔板中（2×105/孔），待細(xì)胞融合達(dá)80%左右，參照siRNA-mate說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h收集細(xì)胞。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)各組細(xì)胞OTX2蛋白表達(dá)：消化MC3T3-E1，并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL，分別取100 μ L單細(xì)胞懸液滴加在預(yù)先放置無(wú)菌蓋玻片的6孔板內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，取出細(xì)胞爬片，冷丙酮固定30 min，用30%過(guò)氧化氫+純甲醇混合液浸泡35 min，PBS沖洗，再用5%BSA封閉30 min，滴加1∶400稀釋的一抗，4 ℃反應(yīng)16 h，PBS沖洗，再滴加二抗37 ℃孵育20 min，PBS沖洗，SABC試劑繼續(xù)孵育20 min，最后用加入含0.015%Tween20的PBS洗滌切片，DAB顯色3 min，封片，觀察。20倍物鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算各組陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。選取免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)后干擾效果最好的一組OTX2-siRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：消化轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，以2×104/mL濃度接種于96孔板，每孔200 μ L混勻。設(shè)立不含細(xì)胞的空白組，共4組，每組設(shè)4個(gè)平行孔。轉(zhuǎn)染48 h后，每孔中加入1×MTT 50 μ L，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出上清液，加入DMSO150 μ L，平板搖床搖勻5 min，使其充分溶解，利用酶標(biāo)儀在550 nm處讀取光密度 （optical density，OD） 值。計(jì)算比較各組細(xì)胞抑制率［細(xì)胞抑制率（%） =1- （OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組） /（OD對(duì)照組-OD空白組） ×100］。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：無(wú)EDTA的胰酶消化轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞，取1 mL單細(xì)胞懸液 （濃度為1×106/mL） ，離心去上清，70%冷乙醇4 ℃過(guò)夜，沖洗離心后加入100 μ L RNase A，37 ℃水浴30 min，加入400 μ L 碘化丙啶 （propidium iodide，PI） 避光染色，4 ℃靜置30 min，上機(jī)檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處紅色熒光，計(jì)算各組細(xì)胞S期細(xì)胞比例和增殖指數(shù)。

1.2.5 AnnexinV-EGFP/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞消化后，2 000 r/min離心5 min收集，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，離心收集細(xì)胞，加入500 μ L Binding Buffer重新懸浮細(xì)胞，再依次加入5 μ L AnnexinV-EGFP混勻，5 μ L PI混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 化學(xué)比色法檢測(cè)ALP合成情況：吸取轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞培養(yǎng)液，2 500 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行測(cè)定。按照ALP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明配制反應(yīng)液，分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和測(cè)定孔，充分混勻并置于37 ℃水浴15 min，輕輕振搖孔板混勻，于波長(zhǎng)520 nm，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值。培養(yǎng)液中ALP活力（金氏單位/100 mL） =［ （測(cè)定OD值-空白OD值） / （標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值） ］×酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度 （0.1 mg/mL） ×100 mL×樣品測(cè)定前稀釋倍數(shù)。

1.2.7 MDC檢測(cè)細(xì)胞自噬水平：細(xì)胞爬片轉(zhuǎn)染48 h后，棄掉原培養(yǎng)基，加入300 μ L 1×wash buffer洗滌，每孔加入100 μ L配置好的MDC染色工作液，室溫避光染色20 min。300 μ L 1×wash buffer清洗3次，滴加100 μ L collection buffer，加蓋玻片。熒光顯微鏡下用紫外光激發(fā)，觀察、拍照。高倍鏡 （×40） 下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算綠色熒光細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)多組間參數(shù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞OTX2蛋白表達(dá)情況

與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，3個(gè)OTX2-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞染色明顯變淺，OTX2蛋白表達(dá)水平下調(diào)。陽(yáng)性細(xì)胞百分率計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，OTX2-mus-868組為（37.0±2.0） %、 OTX2-mus-1027組為（49.2±1.9） %、OTX2-mus-1225組為（45.0±1.6） %，陰性對(duì)照組為（96.4±2.0） %、空白對(duì)照組為（96.6±1.1） %，3個(gè)OTX2轉(zhuǎn)染組與陰性對(duì)照組之間陽(yáng)性細(xì)胞百分比的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05） ，其中OTX2-mus-868組表達(dá)水平最低，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用OTX2-mus-868轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組；陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞ 0.05） ，見圖1～2。

2.2 OTX2抑制對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性的影響

圖1 轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞OTX2免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果 ×200Fig.1 Immunocytochemical staining results of OTX2 in each group after 48 h of transfection ×200

圖2 轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞OTX2陽(yáng)性細(xì)胞百分率Fig.2 Percentage of OTX2 positive cells in each group after 48 h of transfection

MTT結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組OD值分別為0.28±0.02，0.34±0.04，0.34±0.03。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率為 （47.04±7.02） %，與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05） ，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞ 0.05） ，見表1。

2.3 OTX2抑制對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染OTX2-siRNA后S期細(xì)胞比率和增殖指數(shù)明顯減小，與陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05） ，而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞ 0.05） 。見表2。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果

轉(zhuǎn)染48 h后，AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組總凋亡率差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞ 0.05） ，見圖3、表3。

表1 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞OD值和增殖抑制率Tab.1 OD value and proliferation inhibition rate of each group after transfection

表2 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞S期比例及增殖指數(shù)Tab.2 S phase ratio and proliferation index of cells in each group after transfection

圖3 轉(zhuǎn)染48 h后MC3T3-E1細(xì)胞凋亡情況Fig.3 Apoptosis of MC3T3-E1 cells transfected for 48 h

表3 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的總凋亡率和早期凋亡率 （%）Tab.3 Total apoptotic rate and early apoptotic rate of cells in each group after transfection （%）

2.5 OTX2抑制對(duì)細(xì)胞ALP合成的影響

與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞ALP活性明顯下降 （P＜ 0.05） ；而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，則無(wú)明顯變化 （P＞ 0.05） ，表明OTX2表達(dá)下調(diào)后MC3T3-E1細(xì)胞的分化能力明顯減弱。見表4、圖4。

2.6 轉(zhuǎn)染后成骨細(xì)胞自噬水平改變

MDC熒光染色可以觀察細(xì)胞的自噬水平。如圖5所示，實(shí)驗(yàn)組MDC染色熒光強(qiáng)度低，點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)少，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組染色強(qiáng)度高，點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)多。實(shí)驗(yàn)組熒光細(xì)胞百分比為（3.11±0.07） %，陰性對(duì)照組為（9.36±1.25） %，空白對(duì)照組為（10.54±2.89） %。實(shí)驗(yàn)組熒光細(xì)胞比例低于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05） 。

表4 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞上清液OD值及ALP活力值Tab.4 OD value and ALP activity value of supernatant in each group after transfection

圖4 轉(zhuǎn)染48 h后MC3T3-E1細(xì)胞ALP合成情況Fig.4 ALP synthesis of MC3T3-E1 cells after transfection for 48 h

3 討論

自噬是一種溶酶體介導(dǎo)的降解途徑，在基礎(chǔ)條件和壓力條件下降解細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)壽蛋白質(zhì)或受損傷細(xì)胞器，使其成為細(xì)胞所需的三磷酸腺苷和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，用來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)［9-10］。目前，研究證實(shí)自噬對(duì)于骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的形成和分化起著不可缺少的調(diào)節(jié)作用。在氟或鉛的應(yīng)激環(huán)境下，可以引起小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1的凋亡增加，增殖減少，并誘導(dǎo)其發(fā)生自噬，而發(fā)生自噬后的成骨細(xì)胞，增殖能力反而增強(qiáng)［11-12］，表明自噬可作為一種保護(hù)機(jī)制，減輕外界環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞的損傷，減少成骨細(xì)胞凋亡。

圖5 MDC熒光染色轉(zhuǎn)染后的MC3T3-E1細(xì)胞 ×400Fig.5 MDC fluorescent staining of MC3T3-E1 cells after transfection ×400

OTX2基因最早出現(xiàn)在胚胎形成初期的內(nèi)胚層和外胚層，在間腦、中腦等區(qū)域中有表達(dá)，對(duì)于眼、頜骨及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育具有重要作用［13］。敲除OTX2基因的純合子小鼠胚胎致死率明顯升高且出現(xiàn)無(wú)下頜畸形，小鼠的第三菱腦結(jié)構(gòu)不能正常發(fā)育，說(shuō)明OTX2在顱腦前部的發(fā)育中具有重要作用［14-15］，而中腦和菱腦的形成與顱頜面骨的發(fā)育密切相關(guān)。OTX2在下頜骨遠(yuǎn)中區(qū)域和下頜骨前部發(fā)育的中腦神經(jīng)嵴細(xì)胞中有表達(dá)［16-17］，提示OTX2對(duì)于頜骨的發(fā)育可能起重要作用。本研究通過(guò)下調(diào)MC3T3-E1中OTX2基因的表達(dá)，研究其對(duì)成骨細(xì)胞的增殖以及自噬的影響，為研究下頜骨過(guò)度發(fā)育的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果表明，OTX2-siRNA能下調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞中OTX2基因的表達(dá)，抑制MC3T3-E1增殖，而對(duì)其凋亡水平無(wú)明顯影響。ALP是骨形成的特異性酶，具有促進(jìn)骨礦化的能力，常常通過(guò)其活性高低來(lái)表示成骨細(xì)胞的分化水平［18］。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后成骨細(xì)胞上清液OD值明顯減小，ALP活力單位降低，表明OTX2基因表達(dá)下調(diào)可以明顯降低MC3T3-E1細(xì)胞的分化水平。MDC是一種嗜酸性染液，可以選擇性地結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)自噬小體的囊泡膜上，是一種用來(lái)檢測(cè)自噬水平的熒光染色劑。本研究中，MDC染色結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后的MC3T3-E1細(xì)胞染色強(qiáng)度弱，點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)少，提示OTX2基因表達(dá)下調(diào)后，MC3T3-E1自噬水平降低。本研究組將進(jìn)一步通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)建立OTX2差異表達(dá)的成骨細(xì)胞模型，通過(guò)誘導(dǎo)和抑制細(xì)胞自噬水平來(lái)觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)性征的影響，探討可能存在的信號(hào)調(diào)控通路。