PD-1／PD-L1 信號調(diào)節(jié)在類風濕性關節(jié)炎的研究進展*

殷淑瑛，呂巧怡，王薈，邵啟祥，2（.江蘇大學醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江 2203；2.江蘇護理職業(yè)學院醫(yī)學技術學院，江蘇淮安 223005）

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是常見的自身免疫性疾病，約影響全球0.5%～1.0%的成年人，RA 的發(fā)病機制復雜，目前認為與環(huán)境因素，DNA 甲基化，免疫耐受被打破，T、B 細胞功能失調(diào)以及免疫炎癥等密切相關［1-2］。近年來有關程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）／PD-L1 信號在RA 病程中的作用機制、臨床檢測方法和靶向治療方面有了長足的進展，本文就上述研究進展作一綜述。

1 RA 患者PD-1／PD-L1 信號調(diào)節(jié)T 細胞功能的機制

研究發(fā)現(xiàn)，PD-1 分子的表達與RA 疾病進程有關，PD-1在RA 活動期的表達水平顯著高于RA 緩解期，即使在緩解期，PD-1 的表達水平也明顯高于健康人對照［3］。盡管PD-1在RA 患者滑膜組織及外周血T 細胞、B 細胞和DCs 等細胞表面呈高表達，但相關研究表明PD-L1 在RA 患者滑膜組織中的表達降低，且RA 患者血清或滑膜液中存在可溶性PD-1（soluble programmed death 1，sPD-1）、sPD-L1 或PD-1 蛋白自身抗體等干擾PD-1／PD-L1 信號通路的分子［4-6］，導致PD-1信號不能發(fā)揮負向調(diào)控作用。另外，參與RA 致病的免疫細胞的分化、代謝、功能調(diào)控也受到PD-1／PD-L1 通路的調(diào)控［7］。目前，針對PD-1 的人源化免疫球蛋白G1 單克隆抗體Peresolimab 在RA 患者的Ⅱ期臨床試驗已顯示出較好的治療效果［8］。由此可見，明確PD-1／PD-L1 信號對RA 病程進展的影響機制至關重要。

1.1 sPD-1 對RA 患者T 細胞PD-1／PD-L1 信號的調(diào)控sPD-1 由mRNA 的剪接或膜蛋白的裂解產(chǎn)生，是PD-1／PD-L1信號通路的阻斷劑，當sPD-1 與PD-L1 特異性結合，可阻斷PD-1／PD-L1 通路負性信號的轉(zhuǎn)導。既往研究表明，sPD-1在慢性感染、抗腫瘤免疫和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。在RA 患者滑膜液和血清中sPD-1 的濃度顯著高于健康人對照組，且與DAS28 評分和臨床活動期有關，經(jīng)過治療后的RA 患者血清sPD-1 的濃度顯著降低［9］。sPD-1 抑制負向調(diào)控機制可能是過多的sPD-1 競爭性結合細胞表面PD-1配體，使得PD-1 結合配體相對減少，抑制PD-1 的負性調(diào)控作用，加快、加劇關節(jié)炎的發(fā)生和關節(jié)損傷。另外，RA 的發(fā)生、發(fā)展與促炎細胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-21 和IL-17A）的產(chǎn)生有關，有學者發(fā)現(xiàn)，這些炎性因子作用于T細胞可誘導sPD-1 的產(chǎn)生，經(jīng)腹腔注射PD-1 蛋白至CIA 小鼠模型可使小鼠體內(nèi)TH1／TH17 數(shù)量增加，導致TH1／TH17 比例失衡，關節(jié)嚴重受損［10］。綜上所述，sPD-1 通過阻斷PD-1 信號通路的轉(zhuǎn)導或使TH1／TH17 比例失衡，加速RA 進展。

1.2 信號淋巴細胞活化分子相關蛋白［signaling lymphocytic activation molecule（SLAM）-associated protein，SAP］對RA 患者T 細胞PD-1／PD-L1 信號的調(diào)控 T 細胞是介導自身免疫性疾病的關鍵細胞，RA 患者外周血和滑膜組織中CD3+T細胞中PD-1 的表達水平顯著高于健康人對照組，并且與疾病活動度呈正相關［11］，這表明隨著RA 患者病情的進展，疾病活動度越高則PD-1+T 細胞比例越高。PD-1 作為負向調(diào)控分子在RA 患者T 細胞中呈高表達，但并沒有發(fā)揮其負向調(diào)控作用。因此，Sandigu 等［12］推斷PD-1 信號在RA 疾病進展中被阻斷，具有阻斷PD-1 信號的SAP 高表達于RA 患者T 細胞，且與疾病活動性密切相關。SAP 作為一種間接的“分子屏障”使PD-1 下游信號免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序（immuno-receptor tyrosine-based switch motif，ITSM）酪氨酸殘基不受含Src 同源性2 的蛋白酪氨酸磷酸酶2（SH2 domaincontaining protein tyrosine phosphatase-2，SHP2）活性的影響，阻止了SHP2 與PD-1 的相互作用，抑制PD-1 信號在T 細胞的負向調(diào)控功能［13］。這可能是PD-1 在RA 中不能發(fā)揮負向調(diào)控作用的另一原因。

2 PD-1／PD-L1 對CD4+T 細胞功能的影響

2.1 PD-1／PD-L1 對濾泡輔助性T 細胞（follicular helper T cells，Tfh）功能的影響 Tfh 是1 個特化的T 細胞亞群，其特征是高表達C-X-C 基序趨化因子受體5（C-X-C motif chemokine receptor type 5，CXCR5）、PD-1、誘導性共刺激分子（inducible costimulatory molecule，ICOS）、CD40L 和IL-21 等分子，這些分子可促進Tfh 發(fā)育并遷移到生發(fā)中心，輔助B 細胞分化發(fā)育，從而產(chǎn)生抗體［14］。在此期間，Tfh 功能缺陷或亢進都會導致機體免疫功能紊亂。Tfh 功能亢進對B 細胞產(chǎn)生過強的輔助信號，使自身反應性B 細胞活化，分泌大量針對自身抗原的抗體，導致RA、SLE 等多種自身免疫性疾病的發(fā)生。在Tfh 發(fā)育過程中PD-1 信號起著重要的調(diào)控作用，初始T 細胞（na?ve T cells，Tn）進入T-B 細胞交界區(qū)發(fā)育是由CXCR5-磷酸肌醇3 激酶（phosphoinositide 3 kinase，PI3K）信號介導的，而PD-1／PD-L1 相互作用則可抑制該信號，使高表達PD-1 的Tn 發(fā)育為Tfh 的數(shù)量下降［15］。另外，ICOS 信號是調(diào)節(jié)Tfh 功能的另一種重要信號的分子，ICOS缺陷患者的鳥苷酸環(huán)化酶（GC）形成受損，且Tfh 和記憶B細胞數(shù)量減少［16］，而ICOS 的表達增加會使Tfh 的比例增加，促進B 細胞向漿細胞分化，產(chǎn)生大量自身抗體，從而導致自身免疫性疾病［17-18］。另有研究表明，PD-1 可下調(diào)ICOS信號，從而抑制淋巴濾泡中Tfh 的增殖，避免B 細胞過度增殖和抗體產(chǎn)生［19］。因此，PD-1 是Tfh 發(fā)育過程中有效的負向調(diào)節(jié)因子。

2.2 PD-1／PD-L1 對外周輔助性T 細胞（peripheral helper T cells，Tph）功能的影響 Tph 是在抗環(huán)瓜氨酸化蛋白抗體陽性的RA 患者滑膜中發(fā)現(xiàn)的一種CD4+T 細胞亞群，該亞群通過分泌趨化因子C-X-C 基序趨化性細胞因子配體13（C-X-C motif chemokine ligand 13，CXCL13），促進炎癥部位淋巴濾泡和三級淋巴樣結構（tertiary lymphoid structure，TLS）的形成，并輔助B 細胞的發(fā)育，進而加重RA 的病情［20-21］。據(jù)文獻報道，促炎因子TNF-α 和IL-6 可上調(diào)CXCL13的表達，而PD-1／PD-L1 信號具有負向調(diào)控CXCL13分泌的作用；當使用抗PD-L1 或PD-L2 的單抗阻斷PD-1 信號后，Tph 增殖加速以及CXCL13 的表達增加［22］。在RA 患者滑膜中，與PD-1-T 細胞相比，PD-1hiCXCR5-Tph 中IL-21、CXCL13、IFN-γ和IL-10mRNA 的表達量顯著增加，說明其具有輔助B 細胞分化的功能。在淋巴聚集體中，PD-1hiCXCR5-T細胞和PD-1hiCXCR5+T 細胞均與B 細胞相鄰；而在淋巴聚集體以外的區(qū)域，與B 細胞相鄰的大多數(shù)是PD-1hiCXCR5-T 細胞。以上結果表明PD-1hiCXCR5-T 細胞具有獨特的能力，可以在淋巴聚集體和炎癥滑膜中廣泛與B 細胞相互作用，促進B 細胞分化為漿細胞并產(chǎn)生抗體［23］。Tph 的這種作用也存在于SLE 患者中，其頻率與疾病活動性相關，并可促進B 細胞表達靶向外周組織的遷移受體，由此可見，Tph 在SLE 中也具有病理潛能［24］。

2.3 PD-1／PD-L1 對調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cells，Treg）功能的影響 Treg 是體內(nèi)具有免疫抑制功能的，以表達叉頭狀／翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3（forkhead box protein 3，F(xiàn)oxp3）、CD25hi為特征的CD4+T 細胞亞群，其缺失或功能異?？蓪е伦陨砻庖卟〉陌l(fā)生［25］。研究發(fā)現(xiàn)，PD-1／PD-L1 信號途徑可調(diào)控Tn 向Treg 的分化。Tn 在PD-L1 包被的磁珠和TGF-β的作用下，可下調(diào)蛋白激酶B（protein kinase B，PKB／Akt）／哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路，同時上調(diào)磷酸酶和緊張素P 同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）等Treg 發(fā)育的關鍵信號分子，從而促使Tn 分化為Treg［26］。另外，Gotot 等［27］通過一系列過繼轉(zhuǎn)移試驗發(fā)現(xiàn)，表達PD-L1 的Treg 通過PD-1／PD-L1信號依賴的方式抑制自身反應性PD-1+B 細胞的活化和自身抗體的產(chǎn)生。在RA 的發(fā)展過程中，Treg 比例降低，功能受到抑制，經(jīng)過甲氨蝶呤治療后患者Tn 向Treg 分化比例增加，疾病進程得到緩解［28］。因此，通過PD-1／PD-L1 信號通路誘導Treg 可能是治療RA 的一種新的策略。

3 PD-1 信號調(diào)節(jié)CD8 記憶T 細胞的產(chǎn)生和代謝

組織駐留記憶T 細胞（tissue-resident memory T cells，Trm）是以CD103 和CD69 為表型的第三類記憶T 細胞亞群，被認為是RA 復發(fā)的關鍵驅(qū)動因素。在RA 患者的滑膜組織中高表達PD-1 的CD8+Trm 比例增加。研究表明，PD-1信號調(diào)節(jié)CD8+T 細胞記憶的形成和維持，與野生型小鼠相比，PD-1 缺失的小鼠在CD8+T 細胞記憶維持階段數(shù)量減少，使得淋巴區(qū)和非淋巴區(qū)CD8+Tm 顯著減少［29］。另外，TCR 信號強度與Tm 細胞的形成呈負相關，PD-1 信號的丟失會增強TCR 信號，使Tm 數(shù)量和功能受損［30］。在代謝方面，PD1 信號軸通過調(diào)節(jié)mTOR 依賴的糖酵解和脂肪酸氧化途徑，滿足靜息CD8+Tm 的能量需求，促進CD8+Tm 的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持。上述結果表明，PD-1 是Tm 形成和代謝維持的調(diào)節(jié)劑［29］。

4 RA 患者PD-1／PD-L1 信號調(diào)節(jié)B 細胞功能的機制

約2／3 的RA 患者產(chǎn)生抗環(huán)瓜氨酸蛋白和／或變性免疫球蛋白（類風濕因子）的抗體。高水平和持續(xù)產(chǎn)生自身抗體表明B 細胞在RA 發(fā)病機制中起重要作用［31］。CXCR3 是記憶B 細胞遷移到滑膜炎癥部位重要的趨化因子受體。大多數(shù)表達CXCR3 的B 細胞在體外激活后可表達PD-1。與PD-1-B 細胞相比，PD-1+B 細胞具有更高的T 細胞共刺激能力和促炎性細胞因子產(chǎn)生能力［32］。PD-1+B 細胞參與糖酵解的基因顯著上調(diào)，Akt／mTOR 通路顯著激活，葡萄糖攝取顯著增加，在阻斷糖酵解途徑后PD-1+B 細胞消失，但目前其具體機制尚不清楚［33］。另有研究表明，在缺乏PD-1 信號的情況下（如PD-1 和PD-1 配體缺乏）導致長壽命漿細胞生成不足，數(shù)量減少，由于漿細胞分化本身不受PD-1 信號的影響，晚期生發(fā)中心更側重于產(chǎn)生長壽命漿細胞［34］。長壽命漿細胞可以在骨髓中存活數(shù)個月至數(shù)年，即使在缺乏自身反應性T 和B 淋巴細胞慢性激活的情況下，長壽命漿細胞也可繼續(xù)分泌自身抗體［35］。消除自身抗原特異性的長壽命漿細胞對開發(fā)新的免疫治療策略可能是一種新的方向。

5 PD-1／PD-L1 檢測技術的研究進展

傳統(tǒng)的PD-1／PD-L1 檢測方法包括免疫組織化學技術（IHC）、Western blot、ELISA 和流式細胞術（FCM）等。傳統(tǒng)方法均存在一定的局限性，例如IHC 是有創(chuàng)性檢查，重復性差，其結果判讀具有一定的主觀性，易誤診為假陰性結果［36］，Western blot 需要較高濃度的蛋白質(zhì)，在實際應用中并不敏感［37］；ELISA 法需要昂貴的抗體來捕獲和標記靶標，且抗體的質(zhì)量存在差異［38］；FCM 檢測主要應用于外周血檢測，對于組織檢測在臨床應用中有一定的限制性；此外由于個體差異較大，正常參考值的確定比較困難。PD-1／PD-L1表達水平在臨床自身免疫病和腫瘤等疾病診斷和治療中具有重要價值，有望為疾病的靶向治療提供參考。因此，開發(fā)高靈敏度、高精度，適合臨床的檢測方法具有十分重要的意義。目前，除了經(jīng)典方法以外，RNAscope 技術、正電子發(fā)射斷層掃描（positron emission tomography，PET）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS／MS）等多種方法已應用于PD-1／PD-L1 的檢測。

5.1 RNAscope 技術在PD-1／PD-L1 檢測中的應用 RNAscope 技術由美國ACD 公司開發(fā)，用于檢測目的RNA 原位定量雜交的新技術。它克服了IHC 因抗體質(zhì)量、抗體來源及檢測條件等因素不同造成檢測結果不準確的缺點，通過設計特異性的探針，幾乎可實現(xiàn)對所有基因的檢測，具有靈敏度高、特異性強、信噪比高等優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)，RNAscope技術在PD-1／PD-L1 檢測中與IHC［39］、PCR 和二代測序［40］等檢測方法具有較好的一致性。

5.2 PET 技術在PD-1／PD-L1 檢測中的應用 PET 是一種無創(chuàng)、精準、實時、可重復的成像技術，其檢測體內(nèi)PD-1 分子的原理是利用放射性核素標記抗PD-1 抗體或抗體片段制成分子探針，引入活體后，探針靶向識別體內(nèi)的PD-1 分子，然后利用PET 對體內(nèi)的放射性攝取進行測量，實現(xiàn)對體內(nèi)PD-1 分子的定量檢測［41］。PET 探針是PET 影像學研究的先決條件，當核素標記抗PD-1 單克隆抗體作為探針顯像時，其識別PD-1 分子的親和力強，制備方法簡單，但不易被機體迅速代謝，且穿透能力差限制了其臨床應用。核素標記低分子量PD-1 抗體片段、納米抗體顯像時，其穿透性強，半衰期短可被機體快速清除，已展現(xiàn)出巨大的發(fā)展?jié)摿Γ欢?，核素標記低分子量PD-1 抗體片段、納米抗體也存在制備復雜、穩(wěn)定性較差、開發(fā)成本較高等短板［42］。

5.3 LC-MS／MS 技術在PD-1／PD-L1 檢測中的應用LC-MS／MS作為一種靈敏度高、準確性好的蛋白質(zhì)定量技術，可獨立進行蛋白質(zhì)的定量分析，已被廣泛應用于臨床。在PD-1 和 PD-L1 的檢測過程中，Zheng 等［43］利 用LC-MS／MS檢測方法首次使用自動抗肽抗體測定福爾馬林固定石蠟包埋（formalin-fixed and paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）組織中PD-1 和PD-L1 的含量，該方法提高了對FFPE 組織檢測的靈敏度和特異性。在另一項研究中［44］，研究人員開發(fā)了一種完全自動化、超靶向的雙向液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術（two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry，2D-LC-MS／MS）分析血清中的PD-L1 蛋白含量，其靈敏度比傳統(tǒng)LC-MS／MS 高出100 倍。由于該方法靈敏度高，可對目標物質(zhì)進行準確的定量檢測。

6 小結及展望

PD-1／PD-L1 是機體免疫系統(tǒng)的強大調(diào)節(jié)分子信號，RA患者外周血、滑膜腔中的T、B 細胞直接或間接受sPD-1、PI3K／Akt／mTOR、ICOS 等PD-1／PD-L1 上、下游多種信號分子的調(diào)節(jié)，從而影響RA 的臨床表現(xiàn)。目前，在臨床Ⅱ試驗中，PD-1 抗體治療RA 已顯示出較好的療效。因此，通過有效的PD-1 抗體藥物治療，聯(lián)合先進的檢測方法評估PD-1／PD-L1 的表達，有望為臨床治療RA 帶來新的希望和路徑。