轉(zhuǎn)PeTLP基因‘南林895’楊對土壤微生物的影響及外源基因分子檢測

馬曉星，孫偉博，魏 輝，劉 鈴，于 翔，王 璞，諸葛強(qiáng)

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轉(zhuǎn)基因‘南林895’楊對土壤微生物的影響及外源基因分子檢測

馬曉星1，孫偉博1，魏 輝1，劉 鈴1，于 翔2，王 璞1，諸葛強(qiáng)1

（1. 南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，生物與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037；2. 日本理化學(xué)研究所 植物科學(xué)中心，橫濱 日本 230-0045）

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是當(dāng)今林木分子育種的手段之一，但其生物安全性問題廣受關(guān)注。本研究選擇進(jìn)入田間試驗(yàn)的轉(zhuǎn)（類甜蛋白）基因‘南林895’楊cv. ‘Nanlin 895’為材料，開展轉(zhuǎn)基因楊樹對土壤微生物影響及外源基因分子檢測等分析。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因楊樹在進(jìn)入田間試驗(yàn)一年后，外源基因仍穩(wěn)定存在于轉(zhuǎn)基因植株基因組中；轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因植株根系周圍可培養(yǎng)土壤微生物菌落數(shù)量無顯著差異，表明外源基因?qū)ν寥牢⑸餆o顯著影響；對土壤微生物總DNA進(jìn)行分子檢測也顯示外源基因未有向周圍土壤微生物擴(kuò)散現(xiàn)象；葉片化感作用試驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)基因植株葉片未對生菜L.var.Hort.種子的生長造成顯著影響。初步分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因‘南林895’楊在進(jìn)入田間試驗(yàn)后未出現(xiàn)外源基因水平轉(zhuǎn)移，也未對周圍生態(tài)環(huán)境造成顯著影響。

轉(zhuǎn)基因植物；‘南林895’楊；田間試驗(yàn)；生物安全性；

楊屬由于生長迅速、適應(yīng)能力強(qiáng)、產(chǎn)量高、輪伐期短以及用途廣泛等優(yōu)點(diǎn)，已成為全球重要的經(jīng)濟(jì)樹種之一。我國森林資源相對貧乏，每年需要大量進(jìn)口木材才能滿足國家經(jīng)濟(jì)建設(shè)的需要。近幾十年來隨著楊樹產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，楊樹人工林的面積不斷增加，但由于楊樹單一化種植，導(dǎo)致病蟲害發(fā)生情況越來越嚴(yán)重，極大地制約了楊樹產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。因而，如何高效培育抗病蟲害的楊樹新品種已成為育種學(xué)家所面臨的一個迫切問題。轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種目標(biāo)針對性強(qiáng)且周期短，可大大加速育種進(jìn)程[1-3]。

近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)PR-5蛋白具有一定的抗真菌活性。PR-5蛋白是植物在受到生物和非生物脅迫時體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的病程相關(guān)蛋白（PRs），參與多種真菌抗性反應(yīng)過程[4]。由于PR-5蛋白的氨基酸序列與西非熱帶雨林灌木的蘇甜蛋白氨基酸序列高度同源，因此又被稱為類甜蛋白（thaumatin-like proteins，TLPs）[5]。已有許多文章報(bào)道轉(zhuǎn)類甜蛋白基因植物具有一定的抗真菌活性。Mackintosh等將大麥中分離得到的-1轉(zhuǎn)入小麥中過表達(dá)，可以提高對小麥赤霉病的抗性[6]。含有類甜蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草能夠延緩由瓜果腐霉以及立枯絲核菌所引起的疾病的發(fā)生[7]。將光稃稻中的類甜蛋白基因轉(zhuǎn)入小麥中，獲得的轉(zhuǎn)基因小麥對小麥赤霉病具有一定的抗性[8]。Jin等通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將類甜蛋白基因?qū)氲疥栍螅R鈴薯）中，提高了馬鈴薯對晚疫病的抗性[9]。Wang等過量表達(dá)明顯地提高了擬南芥對輪枝菌的抗性[10]。在秈稻L.表達(dá)水稻基因增強(qiáng)了其對水稻紋枯病致病菌以及水稻葉鞘腐敗病菌的抗性[11]。本實(shí)驗(yàn)室從‘南林895’楊×cv. ‘Nanlin 895’克隆獲得了基因，功能分析顯示其具一定的抗病菌活性[12]。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)越來越多地被應(yīng)用于遺傳育種領(lǐng)域，轉(zhuǎn)基因植物潛在的生物安全性也日益受到公眾的關(guān)注[13-17]。目前轉(zhuǎn)基因植物生態(tài)安全評估主要集中在外源基因是否穩(wěn)定存在、外源基因是否會發(fā)生水平轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)基因植物是否會對土壤微生物數(shù)量造成影響以及是否會對周圍非目標(biāo)生物的生長造成影響等。國內(nèi)外關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物生物安全性的研究大多集中于玉米、水稻、棉花等農(nóng)作物上[18]，對轉(zhuǎn)基因林木的生物安全性檢測相對較少。本研究選擇實(shí)驗(yàn)室利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得經(jīng)檢測具一定的抗病菌能力（數(shù)據(jù)未發(fā)表）且經(jīng)申請己準(zhǔn)許進(jìn)入田間試驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因‘南林895’楊為材料，開展轉(zhuǎn)基因楊樹的分子檢測及生物安全性分析，為轉(zhuǎn)基因楊樹抗病新品種培育及應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料選擇進(jìn)入田間試驗(yàn)并于2017年春扦插種植于江蘇泗洪陳圩林場的轉(zhuǎn)基因‘南林895’楊株系（1-2，1-6，1-7，2-9，2-11），以未轉(zhuǎn)基因‘南林895’楊（NL895）（美洲黑楊×歐美楊F1代優(yōu)良無性系）為對照。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外源基因穩(wěn)定性的分子檢測 外源基因能否在受體植物中長期存在并且穩(wěn)定表達(dá)是培育轉(zhuǎn)基因新品種的重要依據(jù)[19]。為此，采集了進(jìn)入田間試驗(yàn)1 a后（2018年4月）的轉(zhuǎn)基因楊樹以及非轉(zhuǎn)基因楊樹葉片，每個株系（加對照共6個株系）隨機(jī)采集3棵植株的幼嫩葉片，3次重復(fù)，低溫保存?zhèn)溆?。提取葉片基因組DNA（采用TIANGEN的植物基因組DNA提取試劑盒），對目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

本研究中轉(zhuǎn)基因楊樹采用的植物表達(dá)載體為PBI121，連接時使用的限制性內(nèi)切核苷酸酶為Xba1和BamH1。目的基因片段長度為750 bp，在本實(shí)驗(yàn)中使用35S啟動子作為上游引物序列，下游引物序列為目的基因的下游序列，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為850 bp左右。

PCR反應(yīng)體系50 μL，包括模板3 μL，10×Buffer 5 μL，2.5 μM dNTP 4 μL，上、下游引物各1 μL，rTaq 0.5 μL，加ddH20至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min；95℃變性50 s，56℃退火50 s，72℃延伸50 s，35個循環(huán)；72℃，10 min。

35S Forward: 5’-CTATCCTTCGCAAGACCCTTC-3’

1 Reverse: 5’-CGGGATCCCTAGTGACAGAAGATAAC-3’

35S Forward: 5’-CTATCCTTCGCAAGACCCTTC-3’

2 Reverse: 5’-CGGGATCCTTAGTGACAAAAGATAACC-3’

1 Forward: 5’-GCTCTAGAATGGCCACCGCCACGCAAC-3’

1 Reverse: 5’- CGGGATCCCTAGTGACAGAAGATAAC-3’

2 Forward: 5’- GCTCTAGAATGACTACTGCTAGGCCAATC-3’

2 Reverse: 5’- CGGGATCCTTAGTGACAAAAGATAACC-3’

1.2.2 可培養(yǎng)土壤微生物的檢測 為了評估轉(zhuǎn)基因植物對于土壤微生物的影響，對試驗(yàn)地進(jìn)行了連續(xù)動態(tài)監(jiān)測。定期（每隔3個月）采集土壤樣本按Yu等人[20]的方法培養(yǎng)土壤微生物并進(jìn)行土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的統(tǒng)計(jì)。土壤微生物培養(yǎng)采用的2個培養(yǎng)基為：四環(huán)素-葡萄糖-酵母提取物培養(yǎng)基（OGYE）和蛋白胨-胰蛋白胨-酵母提取物-葡萄糖培養(yǎng)基（PTYG）。OGYE培養(yǎng)基用于培養(yǎng)土壤中可培養(yǎng)的真菌，其培養(yǎng)基成分為：酵母提取物5.0 g·L-1，葡萄糖20.0 g·L-1，生物素0.1 mg·L-1以及四環(huán)素50.0 mg·L-1。PTYG培養(yǎng)基用于培養(yǎng)可培養(yǎng)的放線菌以及細(xì)菌，其培養(yǎng)基成分為：蛋白胨0.25 g·L-1，胰蛋白胨0.25 g·L-1，酵母提取物0.5 g·L-1，葡萄糖0.5 g·L-1，且含有30.0 mg·L-1的MgSO4·7H2O以及3.5 mg·L-1的CaCl2·2H2O。

土壤采樣時，隨機(jī)選取轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株各3棵，以樣樹為中心，選取主干半徑30 cm距離的等邊三角形的3個頂點(diǎn)，采集10 ~ 20 cm土層處土壤樣品約60 g，該土壤層微生物最為豐富。將采集好的土壤樣品保存于保鮮袋中，放入冰盒保存帶回實(shí)驗(yàn)室，冰箱4℃存放備用。每份土壤樣品約為60 g，30 g放于80℃下過夜烘干，余下的30 g與270 mL無菌且pH值為7的磷酸緩沖液（15 mM）混合，放于160 r·min-1，25℃的搖床上震蕩10 min。使用移液槍準(zhǔn)確吸取0.1 mL土壤懸浮液注入0.9 mL的無菌磷酸緩沖液中得到10-1土壤稀釋液。照此方法稀釋得到10-3土壤稀釋液，吸取0.1 mL的10-3土壤稀釋液接種于含有OGYE培養(yǎng)基與PTYG培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，各重復(fù)3次。將培養(yǎng)皿放置于室溫、黑暗條件下培養(yǎng)，3 d后統(tǒng)計(jì)真菌菌落，7 d后統(tǒng)計(jì)細(xì)菌菌落。為了區(qū)分放線菌與其他細(xì)菌，先統(tǒng)計(jì)總的菌落數(shù)量，然后用70%乙醇在培養(yǎng)基表面輕輕擦拭，剩下的菌落數(shù)量即為放線菌。其他細(xì)菌菌落即為總的細(xì)菌菌落數(shù)量減去剩下的菌落數(shù)量。

菌落形成數(shù)量（CFU）=（微生物數(shù)量×稀釋倍數(shù)）/土壤干重

1.2.3 外源基因水平轉(zhuǎn)移情況分析 參考Muriel. Viaud等的方法[21]將采集的土樣（2018年4月土壤樣品）經(jīng)篩網(wǎng)過篩處理，然后進(jìn)行土壤微生物總DNA的提取。土壤微生物總DNA的提取采用Mpbio公司的FastDNA Spin kit for soil試劑盒。隨機(jī)采取每個株系3份不同的土壤樣品用于總DNA的提取，共采取18個土壤樣品。

以提取的土壤微生物總DNA為模板，使用細(xì)菌16S rDNA通用引物PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)的引物序列如下，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為1 050 bp。

16S rDNA Forward：5’-ACG GGC GGT GTG TAC-3’

16S rDNA Reverse：5’-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’

PCR反應(yīng)體系50 μL，包括模板3 μL，10×Buffer 5 μL，2.5 μM DNTP 4 μL，上、下游引物各1 μL，rTaq 0.5 μL，加ddH20至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min；95℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃，10 min。

以土壤微生物總DNA為模板，質(zhì)粒DNA為陽性對照，設(shè)計(jì)Ⅱ基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)的引物序列如下，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為795 bp。

ⅡForward：5’- ATG ATT GAA CAA GAT GGA TTG C-3’

ⅡReverse：5’- TCA GAA GAA CTC GTC AAG AAG G-3’

PCR反應(yīng)體系50 μL，包括模板3 μL，10×Buffer 5 μL，2.5 μM DNTP 4 μL，上、下游引物各1 μL，rTaq 0.5 μL，加ddH20至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min；95℃變性50 s，56℃退火50 s，72℃延伸50 s，35個循環(huán)；72℃，10 min。

將土壤樣品與磷酸緩沖液（15 mM）混合，將土壤稀釋液涂布于兩類含有卡那霉素（50 mg·L-1）的培養(yǎng)基（OGYE和PTYG）上，從而篩選抗性菌株，提取DNA進(jìn)行分子檢測。細(xì)菌基因組DNA的提取與PCR檢測：挑取菌落到含有10 μL無菌水的PCR管中并混勻，以此做細(xì)菌的DNA溶液。真菌和放線菌基因組的提取[22]與PCR檢測：挑取菌落液體培養(yǎng)，抽濾菌絲。菌絲烘干后搗碎，分別加入1 mL的DNA提取緩沖液（100 mmol·L-1Tris pH 8.0，100 mmol·L-1EDTA，250 mmol·L-1NaCl，1%SDS），50 μL的20%SDS，75 μL的5 mol·L-1NaCl，65 μL的10%CTAB，充分混勻，65℃水浴1 h。12 000 r·min-1離心10 min，取上清。加等體積氯仿/異戊醇（24:1），12 000 r·min-1離心5 min，取上清。加入0.6倍體積的冰異丙醇，混勻放－20℃冰箱過夜沉淀。次日取出，12 000 r·min-1離心15 min，棄上清。用70%，100%乙醇各清洗一次，干燥沉淀DNA，除去多余的乙醇。加入200 μL TE緩沖液即可獲得DNA溶液。將獲得的用于PCR擴(kuò)增的DNA溶液使用分光光度計(jì)檢測其純度和濃度，確?？蛇M(jìn)行PCR擴(kuò)增。

以獲得的DNA溶液為模板，以35S啟動子作為上游引物序列，目的基因的下游序列作為下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為850 bp左右。PCR反應(yīng)體系50 μL，包括模板3 μL，10×Buffer 5 μL，2.5 μM DNTP 4 μL，上、下游引物各1 μL，rTaq 0.5 μL，加ddH20至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min；95℃變性50 s，56℃退火50 s，72℃延伸50 s，35個循環(huán)；72℃，10 min。

35S Forward: 5’-CTATCCTTCGCAAGACCCTTC-3’

1 Reverse: 5’-CGGGATCCCTAGTGACAGAAGATAAC-3’

35S Forward: 5’-CTATCCTTCGCAAGACCCTTC-3’

2 Reverse: 5’-CGGGATCCTTAGTGACAAAAGATAACC-3’

1.2.4 葉片化感作用試驗(yàn) 用Sandwich方法[23-24]初步評估了轉(zhuǎn)基因楊樹是否會對周圍其它植物造成負(fù)面影響。在2017年6月至2017年10月和2018年5月期間每月采集楊樹葉片樣本，每個株系采集的葉片來自于同一個株系9棵不同的楊樹。采集的新鮮葉片放置于60℃條件下烘24 h，烘干的葉片存放于干燥環(huán)境下。葉片化感作用試驗(yàn)使用美國康寧的6孔板（6孔，孔直徑34.8 mm，生長面積9.5 cm2），將烘干葉片（150 mg）平均放入3個孔中。倒入5 ml 0.5% w·v-1的低熔點(diǎn)瓊脂，待瓊脂凝固后再加入5 ml 0.5% w·v-1的低熔點(diǎn)瓊脂。之后每個孔中放入5顆生菜種子（L. var.Hort.），于暗環(huán)境，25℃條件下培養(yǎng)72 h。之后放于－20℃冰箱內(nèi)冷凍1晚，次日取出，測量生菜下胚軸與胚根長度。測量得到的5個數(shù)據(jù)去掉最大值與最小值，采用剩下的3個值得到平均數(shù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Excel 2003進(jìn)行兩因素方差分析[25]，采用OrigiPro 8.0軟件分析可培養(yǎng)土壤微生物數(shù)量的變化情況以及葉片化感作用實(shí)驗(yàn)中下胚軸與胚根長度的變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源基因穩(wěn)定性的分子檢測

從轉(zhuǎn)基因‘南林895’楊植株和非轉(zhuǎn)基因植株葉片中提取基因組DNA，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示（圖1），點(diǎn)樣孔1使用引物為目的基因的上、下游引物，以‘南林895’楊基因組DNA為模板，擴(kuò)增出了約750 bp的片段，與預(yù)期長度相符。點(diǎn)樣孔2～7使用的上游引物為35S啟動子序列，在對照植株（非轉(zhuǎn)基因‘南林895’楊）中使用35S啟動子未擴(kuò)增出目的片段，但在轉(zhuǎn)基因‘南林895’楊（1-2，1-6，1-7，2-9，2-11）基因組DNA中擴(kuò)增出了約850 bp的片段長度，與預(yù)期長度相符。分析表明，轉(zhuǎn)基因楊樹在進(jìn)入田間試驗(yàn)1 a后，外源基因仍穩(wěn)定存在于轉(zhuǎn)基因楊樹基因組中。

M－DNA Marker 2 000；1－2 ‘南林895’楊基因組DNA；3～7－轉(zhuǎn)PeTLP基因‘南林895’楊基因組DNA。

Figure 1in transgenic plants by PCR amplification

2.2 根系周圍土壤微生物種群數(shù)量的比較

對田間試驗(yàn)1 a數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)果整理分析，3類土壤微生物數(shù)量在不同月份的變化趨勢基本一致，且不同微生物數(shù)量在轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因株系之間的變化趨勢也基本保持一致。2018年1月，3類土壤微生物數(shù)量達(dá)到最低值，但之后隨著氣溫的上升3類土壤微生物數(shù)量逐漸增加。放線菌與其他細(xì)菌的數(shù)量在2017年4月達(dá)到了最大值，之后隨著時間的變化呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。真菌數(shù)量則在2018年4月達(dá)到了最大值，2017年4－10月真菌數(shù)量變化差異不大（圖2，圖3，圖4）。

圖2 轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株根系周圍土壤真菌數(shù)量隨季節(jié)變化情況

Figure 2 Seasonal change in numbers of soil fungi of transgenic and non-transgenic plants

圖3 轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株根系周圍土壤放線菌數(shù)量隨季節(jié)變化情況

Figure 3 Seasonal change in numbers of actinomycetes in soil of transgenic and non-transgenic plants

圖4 轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株根系周圍土壤其他細(xì)菌數(shù)量隨季節(jié)變化情況

Figure 4 Seasonal change in numbers of other bacteria in soil of transgenic and non-transgenic plants

用兩因素方差分析（表1）顯示，真菌（α=0.01）、放線菌（α=0.01）、其他細(xì)菌（α=0.01）的群落數(shù)量之間隨著季節(jié)的變化有著極顯著性差異（α=0.01），但是轉(zhuǎn)基因楊樹與非轉(zhuǎn)基因楊樹之間土壤微生物的菌落數(shù)量間無顯著性差異。這一結(jié)果表明該試驗(yàn)林內(nèi)轉(zhuǎn)基因‘南林895’楊未對土壤中可培養(yǎng)真菌、放線菌以及其他細(xì)菌的數(shù)量造成顯著影響。

表 1 轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因植株土壤微生物方差分析結(jié)果

2.3 外源基因水平轉(zhuǎn)移情況分析

隨機(jī)采取每個株系3份不同的土壤樣品用于總DNA的提取，用Mpbio公司的Fast DNA Spin kit for soil試劑盒所提取的根系周圍土壤微生物總DNA為模板，用細(xì)菌16S rDNA通用引物擴(kuò)增，所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5，孔1 ~ 6分別為NL895，1-2，1-6，1-7，2-9，2-11植株周圍土壤微生物總DNA，擴(kuò)增出了1 050 bp左右的片段，與預(yù)期目的片段長度相符。

以根系周圍土壤微生物總DNA為模板，質(zhì)粒DNA為陽性對照，用Ⅱ基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，陽性質(zhì)粒擴(kuò)增出了約795 bp的長度，但轉(zhuǎn)基因楊樹周圍土壤微生物總DNA中并未擴(kuò)增出Ⅱ基因目的片段，表明Ⅱ基因未向周圍土壤微生物發(fā)生基因擴(kuò)散現(xiàn)象。

M－DNA Marker 2000；1－‘南林895’楊周圍土壤微生物總DNA；2～6－轉(zhuǎn)PeTLP基因‘南林895’楊周圍土壤微生物總DNA。

Figure 5 Total DNA of soil microbes by PCR amplification with 16S rDNA

M－DNA Marker 2000；1－質(zhì)粒；2－‘南林895’楊周圍土壤微生物總DNA；3～7－轉(zhuǎn)PeTLP基因‘南林895’楊周圍土壤微生物總DNA。

Figure 6 Total DNA of soil microbes by PCR amplification withⅡ

將土壤稀釋液涂布于兩類含有卡那霉素（50 mg·L-1）的培養(yǎng)基（OGYE和PTYG）上，獲得抗性菌株，其中其他細(xì)菌18株，放線菌8株，真菌9株。對抗性菌株中提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖7所示，以質(zhì)粒作為陽性對照獲得了目的片段，但在篩選的抗性菌株DNA中均未檢測到目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，表明外源基因并未向周圍土壤微生物發(fā)生基因擴(kuò)散現(xiàn)象。

M－DNA Marker 2000；1－質(zhì)粒；2～4－土壤微生物總DNA；4～7－放線菌DNA；7～10－其他細(xì)菌DNA；11～13－真菌DNA。

Figure 7 Horizontal exogenous gene transfer into soil by PCR amplification

2.5 葉片化感作用效應(yīng)檢測

楊樹作為我國人工林發(fā)展的重要樹種，是生態(tài)防護(hù)林的主要成員。防護(hù)林樹種對農(nóng)林生態(tài)系統(tǒng)的影響，尤其是對農(nóng)作物的化感作用影響是一個備受關(guān)注的問題[26-29]。因此，本文通過Sandwich實(shí)驗(yàn)方法探究了轉(zhuǎn)基因‘南林895’楊和非轉(zhuǎn)基因‘南林895’楊對生菜種子萌發(fā)和幼苗生長的影響（圖8，圖9）

圖8 利用“Sandwich”實(shí)驗(yàn)方法所獲得的生菜下胚軸長度

Figure 8 Length of hypocotyl ofL. var.Hort.by Sandwich Sandwich by Sandwich method

圖9 利用“Sandwich”實(shí)驗(yàn)方法所獲得的生菜胚根長度

Figure 9 Length of ofL. var.Hort. by Sandwich method

利用兩因素方差分析（表2）結(jié)果顯示，生菜下胚軸（α=0.01）、胚根（α=0.01）長度隨著月份的變化有著極顯著差異，但是不同的葉片（轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株葉片）對生菜生長的影響無顯著性差異。但當(dāng)和對照組（培養(yǎng)基中不含任何葉片）相比時，培養(yǎng)基中含有葉片的實(shí)驗(yàn)組中生菜下胚軸、胚根的長度與對照組相比有極顯著差異（α=0.01）。

表 2 轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因植株葉片對生菜種子生長影響方差分析

3 結(jié)論與討論

轉(zhuǎn)基因植物釋放到大田后可能存在的風(fēng)險(xiǎn)主要包括：導(dǎo)入的基因通過花粉傳播和雜交使近緣物種獲得該基因；通過水平轉(zhuǎn)移到其他生物特別是微生物中；外源基因在受體植物中是否能夠長期穩(wěn)定表達(dá)；因抗性產(chǎn)生和發(fā)展而導(dǎo)致所轉(zhuǎn)入基因效能的喪失，并由此而造成農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量的巨大損失；所導(dǎo)入的抗性基因?qū)Ψ前袠?biāo)動物、植物和微生物造成的不利影響，以及由此引發(fā)的生態(tài)系統(tǒng)的紊亂等[30]。

外源基因能否在受體植物中長期穩(wěn)定存在是檢測轉(zhuǎn)基因植物生物安全性的前提[19]。為此在轉(zhuǎn)基因‘南林895’楊進(jìn)入田間試驗(yàn)后一年，我們對轉(zhuǎn)基因楊樹進(jìn)行了分子檢測。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因楊樹在進(jìn)入田間試驗(yàn)后一年，基因仍然穩(wěn)定地存在于轉(zhuǎn)基因植株基因組中。

本研究材料使用轉(zhuǎn)基因‘南林895’楊，‘南林895’楊為雌株，不產(chǎn)生花粉，因此不存在花粉傳播而引起的基因污染。土壤微生物是土壤的重要組成部分，在土壤有機(jī)物質(zhì)的降解、營養(yǎng)物質(zhì)的礦化與固定、植物病理的調(diào)控以及土壤結(jié)構(gòu)的改善等方面發(fā)揮著重要作用[31-33]。轉(zhuǎn)基因植物在進(jìn)入大田后就會與土壤中的整個微生物區(qū)系相互作用，有可能會對土壤微生物的種類、數(shù)量等造成一定的影響。本研究結(jié)果顯示真菌、放線菌、其他細(xì)菌的菌落數(shù)量隨著季節(jié)的變化有著極顯著性差異（α=0.01），但是轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因植株之間土壤微生物的菌落數(shù)量無顯著性差異，表明該轉(zhuǎn)基因楊樹的種植并未對試驗(yàn)地土壤微生物造成顯著性影響。朱文旭和呂秀華也獲得了相似的結(jié)果，朱文旭[34]等研究8年生轉(zhuǎn)基因庫安托楊‘Guariento’發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因楊樹的種植未對周圍土壤微生物造成顯著性影響。呂秀華[35]等研究轉(zhuǎn)基因銀中楊‘Berolinensis’對土壤根際微生物的影響，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因銀中楊對其根際土壤微生物主要類群的數(shù)量影響不顯著。

本研究使用Ⅱ基因引物對土壤微生物總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示土壤微生物總DNA中并未擴(kuò)增出Ⅱ基因目的片段。Ⅱ基因編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，能賦予細(xì)胞抗卡那霉素的能力。為進(jìn)一步驗(yàn)證Ⅱ基因是否發(fā)生了外源基因的水平轉(zhuǎn)移，我們用兩類含有卡那霉素（50 mg·L-1）的培養(yǎng)基篩選抗性菌株，獲得了35株抗性菌株。單純的檢測土壤中卡那抗性微生物的菌落并不能反映轉(zhuǎn)基因植物中外源基因轉(zhuǎn)移到微生物[36]，因?yàn)槲⑸镒詭Э强剐院推渌箍腔虻拇嬖诘瓤梢蕴岣呶⑸飳τ诳敲顾氐牡挚沽?，目前所知道的卡那抗性基因至少?0種。為此我們將獲得的卡那抗性菌株提取DNA，用35S啟動子序列作為上游引物，目的基因下游序列作為下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示抗性菌株并未擴(kuò)增出目的片段，檢測結(jié)果表明本研究使用的外源基因并未發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。Smalla等人[37]也得到了相似的結(jié)果，他們在種植含Ⅱ的轉(zhuǎn)基因甜菜L.大田里篩選到了抗性菌株，但PCR和雜交鑒定并沒有發(fā)現(xiàn)基因水平轉(zhuǎn)移。

轉(zhuǎn)基因楊樹在獲得某種抗性的同時是否會因?yàn)椤巴庠椿颉钡牟迦攵淖兤湓瓉淼纳砩卣?，使其化感作用的能力與非轉(zhuǎn)基因樹種相比大幅增強(qiáng)，進(jìn)而演變?yōu)椤巴鈦砦锓N”入侵的趨勢。因而在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過Sandwich實(shí)驗(yàn)方法探究了轉(zhuǎn)基因植株葉片的化感作用，結(jié)果顯示生菜下胚軸、胚根長度隨著月份的變化有著極顯著差異（α=0.01），但是不同的葉片（轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株葉片）對生菜的生長無顯著性差異，說明轉(zhuǎn)基因植株葉片并未對生菜種子的生長造成顯著性影響。

由于楊樹生長周期長，因此轉(zhuǎn)基因楊樹對周邊生態(tài)環(huán)境影響持久，并且可能會在相對較長的時間內(nèi)逐漸表現(xiàn)。因而本研究所開展的基因穩(wěn)定性檢測、外源基因是否發(fā)生水平轉(zhuǎn)移以及葉片化感作用的檢測僅為初步結(jié)果，仍有必要持續(xù)對轉(zhuǎn)基因楊樹進(jìn)行生物安全檢測分析。

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Effect of Transgenic×cv.‘Nanlin 895’ withon Soil Microbes and Molecular Analysis on Exogenous Genes

MA Xiao-xing1，SUN Wei-bo1，WEI Hui1，LIU Ling1，YU Xiang2，WANG Pu1，ZHUGE Qiang1

（1. Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, College of Biology and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 2. RIKEN Plant Science Center, Yokohama 230-0045, Japan）

Transgeniccv. ‘Nanlin 895’ withgene were selected for molecular analysis and biosafety analysis. The results showed that the exogenous gene could be detected after one year plantation of transgenic poplars in the open field. There was no significant difference in the quantity of soil microbes around root system between transgenic and non-transgenic plants, indicating that the transgenic plants withhad no significant effects on soil microbes. Molecular analysis on total DNA of soil microbes showed that the exogenous gene did not transfer to the soil microbes. Allelopathy effect of leaf of transgenic ‘Nanlin 895’ showed that it had no significant effect on the seed growth ofL. var.Hort.

transgenic plants;×cv. ‘Nanlin 895’; field trial; biosafety;

10.3969/j.issn.1001-3776.2018.04.005

S792.11

A

1001-3776（2018）04-0028-10

2018-05-15；

2018-06-22

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2018ZX08020002）；國家林業(yè)局生物安全與遺傳資源管理項(xiàng)目（KJZXSA2018004）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31570650）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目（PAPD）

馬曉星，碩士研究生，主要從事分子生物學(xué)研究；E-mail：1098130946@qq.com。

諸葛強(qiáng)，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事楊樹遺傳改良研究；E-mail：qzhuge@njfu.edu.cn。