松材線蟲果膠酶基因Bxpel1的克隆及其生物信息學(xué)分析

邱秀文，周桂香，王慧娟，楊麗麗

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松材線蟲果膠酶基因1的克隆及其生物信息學(xué)分析

邱秀文1,2,3，周桂香1,2,3，王慧娟3，楊麗麗3

（1. 九江學(xué)院 鄱陽湖生態(tài)經(jīng)濟(jì)研究中心，江西 九江 332005；2. 九江學(xué)院 九江市流域管理與生態(tài)保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 九江 332005；3. 九江學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，江西 九江 332005）

以松材線蟲轉(zhuǎn)錄本為模板，通過RT-PCR技術(shù)克隆果膠酶1基因。結(jié)果表明，松材線蟲果膠酶1基因序列全長為795 bp，GC含量為50.44%，編碼252個(gè)氨基酸。通過Blast比對(duì)克隆的1基因與已知序列（Gen-Bank ID：AB232908.1）的同源性達(dá)到98%。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，1基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列與擬松材線蟲，燕麥真滑刃線蟲的1蛋白序列具有高度同源性。1基因編碼的產(chǎn)物的0 ~ 25序列有可能是跨膜結(jié)構(gòu)域，而其他序列均位于膜外，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是以無規(guī)則卷曲和β-折疊為主，信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)位于第17至第18位氨基酸之間，主要在細(xì)胞外發(fā)揮生物學(xué)作用。1基因的克隆及其生物信息學(xué)分析對(duì)進(jìn)一步研究1基因在松材線蟲致病過程中的功能具有重要意義。

松材線蟲；1基因；克??；生物信息學(xué)

松材線蟲?。≒ine Wilt Disease）是由松材線蟲引起松屬植物死亡的一種世界性森林病害[1-3]。果膠酶基因是松材線蟲的重要致病因子，有研究表明，松材線蟲入侵松樹時(shí)會(huì)分泌大量果膠酶來破壞松屬植物細(xì)胞壁進(jìn)而侵入寄主細(xì)胞[4-5]。然而，目前關(guān)于果膠酶基因在松材線蟲致病過程中的功能還不清楚。果膠由雜多糖和半乳糖醛酸構(gòu)成，是植物細(xì)胞壁的主要成分之一。寄生生物在入侵植物的過程中會(huì)大量分泌果膠酶[6]，導(dǎo)致植物細(xì)胞壁破壞，從而有利于其成功入侵和定殖寄主植物[7]。動(dòng)物果膠酶基因（1）最早是在土豆胞囊線蟲中被發(fā)現(xiàn)[8]。隨后，越來越多報(bào)道顯示許多植物病原性線蟲均有1，如大豆胞囊線蟲[9]和根結(jié)線蟲spp.[10]等。目前關(guān)于1在松材線蟲致病過程中的功能還不清楚，有關(guān)該基因在松材線蟲致病形成的遺傳進(jìn)化機(jī)理也尚不明確。

生物信息學(xué)（Bioinformatics）是由結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)、數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)與生物醫(yī)學(xué)多學(xué)科的一門新興學(xué)科，為功能基因的發(fā)現(xiàn)、基因表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的功能研究提供了新思路。利用生物信息學(xué)與試驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合研究基因結(jié)構(gòu)及其編碼產(chǎn)物的組織結(jié)構(gòu)和信息結(jié)構(gòu)越來越普遍[11]。本研究利用分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)克隆了松材線蟲果膠酶基因（1），并借助生物信息學(xué)相關(guān)軟件預(yù)測(cè)和分析了其編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)、序列特征及相關(guān)生物學(xué)功能，研究結(jié)果有助于從分子水平上理解果膠酶基因1的結(jié)構(gòu)和功能，為進(jìn)一步研究松材線蟲果膠酶基因在松材線蟲致病過程中的功能及其遺傳進(jìn)化機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試松材線蟲選用九江學(xué)院植物基因資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存的蟲株JJU-BLD，該蟲株于2015年8月從江西省九江市星子縣白鹿洞書院一株病死黑松（胸徑45 cm）上分離得到，將松材線蟲接種至灰葡萄孢上，置于25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，保存于4℃冰箱備用。

1.2 松材線蟲總RNA提取

松材線蟲總RNA采用Trizol細(xì)胞裂解液按常規(guī)方法（酚-氯仿）進(jìn)行抽提，然后將抽提物溶解于適量DEPC（Diethyl pyrocarbonate）水中，取少量總RNA進(jìn)行濃度及OD260/OD280比值測(cè)定，把合格的總RNA置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)已公布的松材線蟲1基因的序列（GenBank登錄號(hào)為AB232909.1），利用分子生物學(xué)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)RT-PCR擴(kuò)增引物。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物的長度795 bp。引物序列為：上游引物P1：5'-TTTTGGCATTCTCAGTTGTAGC-3'；下游引物P2：5'-CCATCTTGTCCCTGTTTGTAAG-3′。

1.4 反轉(zhuǎn)錄（Reverse transcription）

按照Transgen公司（中國）生產(chǎn)的EasyScript? First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書合成松材線蟲cDNA，反應(yīng)體系為：Total mRNA 500 ng，Random Primer（N9）（0.1 μg·μl-1）1 μl，2×ES Reaction Mix 10 μl，EasyScript? RT/RI Enzyme Mix 1 μl，添加RNase-free Water至10 μl，輕輕混勻后置于25℃孵育10 min，42℃孵育30 min，85℃加熱5 min后冰上放置。

1.5 PCR擴(kuò)增

以上述cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：Ex Tag Mix 25 μl，引物（10 μM）各1.0 μl，模板DNA 2.0 μl，補(bǔ)ddH2O至50 μl，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃7 min。4℃保存PCR產(chǎn)物。

1.6 PCR產(chǎn)物的回收與純化

PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，利用凝膠成像系統(tǒng)在紫外燈下將目的片段切膠回收，用Axygen公司提供的AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒純化目的片段，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 目的基因的克隆與測(cè)序

在T4 DNA連接酶作用下使PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，然后轉(zhuǎn)染至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含有Amp 50 mg·L-1的X-gal/IPTG的LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16 h。挑選3個(gè)白色單菌落進(jìn)行菌液PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.8 生物信息學(xué)分析

根據(jù)1基因的克隆測(cè)序結(jié)果，利用BioEdit軟件推導(dǎo)出1的氨基酸序列。利用ProtParam工具分析蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)；利用Hopfield神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用Siss-model預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用SignalP v4.0，HMM 2.0和PSORTⅡ分別進(jìn)行信號(hào)肽、蛋白質(zhì)序列的跨膜區(qū)和亞細(xì)胞定位分析。從GenBank中下載其它物種的1基因序列，利用MEGA4軟件將克隆所得到的序列與GenBank上已發(fā)表的擬松材線蟲，燕麥真滑刃線蟲，馬鈴薯腐爛莖線蟲和鏈霉菌屬等序列進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取

采用Trizol試劑法提取松材線蟲總RNA，經(jīng)紫外分光光度測(cè)定，其OD260/OD280比值為1.92，濃度為1 678 ng·μL-1，說明提取的總RNA質(zhì)量合格，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 RT-PCR擴(kuò)增

以提取的松材線蟲總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，8 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，在750 bp ~ 1 000 bp之間，靠近750 bp處有較亮的特異性條帶，與預(yù)期的目的片段的大小（795 bp）一致。

圖1 松材線蟲果膠酶基因RT-PCR產(chǎn)物電泳

Figure 1 Electrophoresis of1 gene amplified by RT-PCR

2.3 陽性重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果比對(duì)及分析

將測(cè)序結(jié)果在NCBI中與松材線蟲已知序列[12]（Gen-Bank ID：AB232908.1）進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果二者之間的同源性為98%（圖2），說明本實(shí)驗(yàn)成功克隆到松材線蟲1基因。BioEdit軟件分析表明，該序列GC含量為50.44%，編碼252個(gè)氨基酸，與擬松材線蟲的同源性為93%。

2.4 Bxpel1基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)

通過相關(guān)生物信息學(xué)軟件（Bio-Edit）和在線網(wǎng)站（http://www.expasy.org）預(yù)測(cè)松材線蟲1基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)。由1基因編碼產(chǎn)物的氨基酸組成（圖3）可知，1基因編碼252個(gè)氨基酸，組分中最多的氨基酸是Gly（甘氨酸），占全部組分的12.7%。1基因編碼的氨基酸理論等電點(diǎn)為8.43，理論分子質(zhì)量約為26.68 ku。

2.5 Bxpel1基因編碼產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過Hopfield神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（HNN）預(yù)測(cè)松材線蟲1基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖4所示，上行為氨基酸序列，下行為其所對(duì)應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中h代表helix（α-螺旋），e代表extended（β-折疊），c代表coil（無規(guī)則卷曲）。從預(yù)測(cè)結(jié)果可知，1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占11.51%，β-折疊占35.32%，無規(guī)則卷曲占53.17%。

圖2 測(cè)序結(jié)果與已知序列的比對(duì)

Figure 2 Comparison of sequencing result between1 and knowns

圖3 Bxpel1蛋白氨基酸組成

Figure 3 Amino acid composition ofprotein

圖4 Hopfield神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（HNN）Bxpel1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

Figure 4 Prediction of secondary structure of1 protein based on HNN

2.6 Bxpel1基因編碼產(chǎn)物的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是在α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上通過側(cè)鏈基團(tuán)的相互作用進(jìn)一步卷曲、折疊而形成特定的構(gòu)象。本研究利用SWISS-MODEL在線預(yù)測(cè)1結(jié)構(gòu)域區(qū)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5顯示，1結(jié)構(gòu)域區(qū)構(gòu)成圓柱狀結(jié)構(gòu)。

2.7 Bxpel1基因編碼產(chǎn)物信號(hào)肽分析

通過在線蛋白質(zhì)序列信號(hào)肽分析工具SignalP4.1對(duì)1基因編碼產(chǎn)物的前70個(gè)氨基酸序列進(jìn)行了分析，程序分別自動(dòng)利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型（NN）進(jìn)行信號(hào)肽分析，并給出了3種C，Y，S-score計(jì)算結(jié)果。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型（NN）預(yù)測(cè)的信號(hào)肽結(jié)果如圖6所示，松材線蟲1編碼產(chǎn)物的分值曲線非常典型，C值為0.599，Y值為0.746，S值為0.970，其切割點(diǎn)位于第17至第18位的氨基酸之間，基本可以判定1編碼產(chǎn)物存在信號(hào)肽。

圖5 Bxpel1蛋白結(jié)構(gòu)域區(qū)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

Figure 5 Prediction of tertiary structure domain of1 protein

圖6 Bxpel1基因編碼產(chǎn)物信號(hào)肽分析

Figure 6 The signal peptide analysis ofl1 gene encoding protein

2.8 Bxpel1基因編碼產(chǎn)物跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析

蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域一般由20 ~ 30個(gè)疏水氨基酸殘基組成，形成一螺旋固著于細(xì)胞膜上起錨定作用。通過使用TMPRED在線預(yù)測(cè)和分析了松材線蟲基因編碼蛋白質(zhì)序列的跨膜區(qū)域。由圖7可知，1基因編碼的產(chǎn)物的0 ~ 25序列有可能是跨膜結(jié)構(gòu)域，而其他序列均位于膜外。

圖7 Bxpel1蛋白跨膜區(qū)域分析

Figure 7 Transmembrane regional analyses of1 protein

2.9 松材線蟲Bxpel1基因編碼產(chǎn)物亞細(xì)胞定位分析

亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)一般通過算法比較查詢序列中所包含的特征參數(shù)與各類相應(yīng)的亞細(xì)胞定位的相似度，然后以一組概率值的形式作出判斷。通過工具PSORTⅡ預(yù)測(cè)，松材線蟲1基因編碼產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位，見表1。從表1可知，其分布在細(xì)胞外的可能性為82.7%，分布在線粒體的可能性為4.3%，分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的可能性為4.3%，分布在細(xì)胞核的可能性為8.7%。因此可以推斷，松材線蟲1基因編碼產(chǎn)物主要在細(xì)胞外發(fā)揮生物學(xué)作用。

表1 Bxpel1 編碼產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位分析

2.10 松材線蟲Bxpel1基因編碼產(chǎn)物的分子進(jìn)化分析

在NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載擬松材線蟲、燕麥真滑刃線蟲、馬鈴薯腐爛莖線蟲和鏈霉菌屬的果膠酶基因的氨基酸序列，利用MEGA 4.0軟件將其與松材線蟲果膠酶基因編碼產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖8。由圖8可知，松材線蟲與擬松材線蟲、燕麥真滑刃線蟲具有高度同源性，分子進(jìn)化距離最近，關(guān)系最為密切，而與馬鈴薯腐爛莖線蟲和鏈霉菌屬進(jìn)化距離相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖8 Bxpel1基因編碼產(chǎn)物的系統(tǒng)進(jìn)化樹

Figure 8 The phylogenetic tree of1

3 結(jié)論與討論

果膠是植物細(xì)胞壁的主要構(gòu)成成分之一，果膠酶基因廣泛存在于植物寄生線蟲基因組中，在線蟲入侵植物的過程中發(fā)揮著重要作用[13-15]。松材線蟲致病性相關(guān)的基因多是在食道腺細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，然后其產(chǎn)物通過口針分泌到寄主體內(nèi)[16-20]。Taisei Kikuchi等[21]研究表明，1基因在松材線蟲食道腺細(xì)胞中表達(dá)，所編碼的多肽活性依賴于Ca2+，在pH值為8 ~ 10時(shí)具有最佳活性。松材線蟲將果膠酶分泌到植物的組織內(nèi)以助其取食與遷移，因此推斷果膠酶基因是松材線蟲關(guān)鍵致病相關(guān)基因。

本研究通過信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，分析基因編碼蛋白功能。通過對(duì)1基因編碼產(chǎn)物進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)1基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列與擬松材線蟲、燕麥真滑刃線蟲的1蛋白序列具有高度同源性，這種同源性在一定程度上代表著物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，同時(shí)也反映了1編碼產(chǎn)物在不同物種結(jié)構(gòu)上的穩(wěn)定性對(duì)生物體的功能重要性。結(jié)果表明，1基因編碼產(chǎn)物由252個(gè)氨基酸組成，其等電點(diǎn)為8.43，分子質(zhì)量約為26.68 ku。1基因編碼產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是以無規(guī)則卷曲和β-折疊為主，主要在細(xì)胞外發(fā)揮生物學(xué)作用，并且預(yù)測(cè)出信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)位于第17至第18位的氨基酸之間，已知信號(hào)肽位于分泌蛋白的N端，它對(duì)于外分泌蛋白的分泌起主導(dǎo)作用[22-23]。利用生物信息學(xué)的方法對(duì)松材線蟲1基因的編碼產(chǎn)物序列進(jìn)行分析，可以了解其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，結(jié)果對(duì)進(jìn)一步研究闡明1基因松材線蟲致病過程中的功能及松材線蟲病的分子致病機(jī)理具有重要意義，同時(shí)為以后試驗(yàn)方案的制定提供了重要理論依據(jù)。

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Cloning and Bioinformatics Analysis of1 Gene from

QIU Xiu-wen1,2,3，ZHOU Gui-xiang1,2,3，WANG Hui-juan3，YANG Li-li3

( 1. Poyang Lake Eco-economy Research Center, Jiujiang University, Jiujiang 332005, China; 2. Jiujiang Key Laboratory of Basin Management and Ecological Protection, Jiujiang University, Jiujiang 332005, China; 3. School of Chemistry and Environmental Engineering, Jiujiang University, Jiujiang 332005, China）

1 gene sequence fromcDNA as a template was amplified and cloned by RT-PCR.1 gene (795bp) was successfully cloned with GC content of 50.44% and encode of 252 amino acids. The cloned sequence had 98% similarity to the pel1 gene previously published in the GenBank (ID: AB232908.1). Phylogenetic analysis showed that1 had high homologies with that fromand.1 gene encode from 0 to 25 sequences may be transmembrane structure, while the other sequences outside membrane. The secondary and tertiary structures were abundant in random coils and beta helix. The signal peptide cleavage sites locate between No. 17 to No. 18 amino acid and performs biological effects at extracellular.

;1 gene; clone; bioinformatics

10.3969/j.issn.1001-3776.2018.04.002

S763

A

1001-3776（2018）04-0008-07

2017-12-25；

2018-05-25

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31660205）；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20161BAB214152，20151BAB213018）

邱秀文，副教授，從事森林病理相關(guān)研究；Ｅ-mail：qiuxiuwen3@163.com。

周桂香，副教授，從事森林生態(tài)相關(guān)研究；Ｅ-mail：727424712@163.com。