王潔，任錫亮，黃蕓萍，安學(xué)君，高天一，孟秋峰

（寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江寧波315040）

榨菜（Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee），學(xué)名莖瘤芥，因其莖在發(fā)育過程中膨大并呈瘤狀凸起，在加工腌制成產(chǎn)品的過程中有壓榨的工藝，所以通常被俗稱為榨菜。榨菜是起源于我國(guó)的一個(gè)芥菜變種，屬于十字花科蕓薹屬[1]。榨菜是我國(guó)重要的對(duì)外出口產(chǎn)品，平均每年出口約20萬t，其營(yíng)養(yǎng)豐富，加工后味道獨(dú)特、脆嫩爽口，與日本醬菜、歐洲酸菜并稱為世界三大名腌菜，深受消費(fèi)者喜愛[2]。

植物雄性不育是指雄性生殖器官無法產(chǎn)生正常功能的花藥、花粉或雄配子的一種遺傳現(xiàn)象，在被子植物中普遍存在。細(xì)胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS）受細(xì)胞核基因、細(xì)胞質(zhì)基因和正常代謝的共同控制，具有相應(yīng)的保持系和恢復(fù)系，在生產(chǎn)上應(yīng)用價(jià)值巨大[3]。蕓薹屬作物擁有豐富的細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型，并在大白菜、甘藍(lán)、油菜和芥菜等作物上得到了廣泛應(yīng)用。目前，已經(jīng)公開報(bào)道的不育系主要有ogu CMS[4]、nap CMS[5]、tour CMS[6]、pol CMS[7]、hau CMS[8]、orf220 CMS[9-10]等。這些起源不同的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系在性狀表現(xiàn)、不育機(jī)制等方面均存在較大差異，因此，從細(xì)胞生物學(xué)的角度系統(tǒng)研究不同類型胞質(zhì)雄性不育系的不育機(jī)制，將為育種工作者更為有效利用這些胞質(zhì)不育源提供重要的參考。

歐新A是史華清等[11]在芥菜型油菜中發(fā)現(xiàn)并選育成的雄性不育材料，不育株率達(dá)100%，不育性世代穩(wěn)定。范永紅等[12]將歐新A不育胞質(zhì)轉(zhuǎn)育到冬榨菜中，育成了多個(gè)榨菜胞質(zhì)雄性不育系。目前，該雄性不育系的分子機(jī)制和不育機(jī)制尚不清楚。前期，我們以冬榨菜歐新A雄性不育系為不育源，育成了不育性狀穩(wěn)定、綜合性狀良好的春榨菜雄性不育系09-05A，并利用該不育系成功培育出了雜交品種。本研究通過對(duì)春榨菜雄性不育系09-05A不同發(fā)育時(shí)期的花藥和花粉進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察，探索花粉敗育的發(fā)生時(shí)期和細(xì)胞學(xué)特征，為春榨菜雄性不育的雜種優(yōu)勢(shì)利用和雄性不育的發(fā)育機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系09-05A及其保持系于2016年10月種植在浙江省寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜研究所生產(chǎn)基地，在正常條件下進(jìn)行栽培管理。次年4月，于盛花期取09-05A不育系和保持系的花序進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和生活力測(cè)定。

1.2 花粉粒形態(tài)掃描電鏡觀察

采集剛開放的花朵，抖動(dòng)花藥使花粉粒散落在貼有雙面膠的金屬載物臺(tái)上，并用牙簽輕輕地將花粉粒涂布均勻，在Eiko IB5離子噴射義中噴鍍金粉4～5 min，之后在Hitachi Model TM-1000型掃描電鏡下觀察花粉粒形態(tài)。

1.3 花粉粒乙酸熒光素染色

將2 mg乙酸熒光素（fluorescein diacetate,FDA）溶于1 mL丙酮中作為母液，儲(chǔ)存在－20℃冰箱中備用。使用前，將FDA母液用0.5 mol/L蔗糖溶液稀釋至0.01%。在載玻片上滴一滴FDA染色液，取剛開放的花朵，用鑷子抖動(dòng)花藥，使花粉粒散落在染色液中，蓋上蓋玻片，趕走氣泡，于室溫、黑暗中放置30 min后，在短藍(lán)光激發(fā)的顯微鏡（DMLB，徠卡，德國(guó)）下拍照觀察。

1.4 花粉粒4’，6-二脒基-2-苯基吲哚染色

在載玻片上滴1滴1 μg/L的4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）染液，取剛開放的花朵，抖動(dòng)花藥使花粉粒散落在染色液中，蓋上蓋玻片，趕走氣泡，于室溫、黑暗中放置30 min后，于紫外燈激發(fā)的顯微鏡（DMLB，徠卡，德國(guó)）下拍照觀察。

1.5 花藥半薄切片觀察

參照王潔[13]的方法，將樣品進(jìn)行包埋處理，用半薄切片機(jī)（LKB 11800）切片，獲得厚度為100 nm的樹脂切片，在載玻片上滴1滴蒸餾水，將樹脂切片放入水滴中，于85℃條件下在REICHERT-JUNG HK120展片機(jī)上展片。將切片用1%亞甲基藍(lán)染色后在顯微鏡（DMLB，徠卡，德國(guó)）下觀察拍照。

1.6 小孢子形態(tài)超薄透射電鏡觀察

將包埋好的小孢子樣品在Richard超薄切片機(jī)中切片，獲得厚度為50 nm的樹脂切片。用具有Fovara膜的銅鎳載網(wǎng)撈片，然后用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色液各染色15 min，干燥后于Hitachi ModelH-7650型透射電鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 不育系09-05A花器官形態(tài)

前期，我們首次將歐新A不育源轉(zhuǎn)育到春榨菜中，經(jīng)多代回交，成功培育了春榨菜雄性不育系09-05A，該不育系與冬榨菜歐新A不育系在葉片形狀、株高、瘤狀莖大小、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期等方面存在明顯差異（表1）。

對(duì)不育系09-05A及其保持系（Ma）的花蕾和開放花的花器官形態(tài)進(jìn)行觀察（圖1）發(fā)現(xiàn)，不育系09-05A在蕾期（開花前5～7 d）表現(xiàn)出明顯的花柱外露現(xiàn)象（圖1E、F），開放花花冠整體較?。▓D1G），花藥狹長(zhǎng)干癟（圖1H、J、K）等特點(diǎn)。分別將09-05A及其保持系的花柱和雄蕊進(jìn)行剝離并比較其長(zhǎng)度發(fā)現(xiàn)，09-05A與其保持系（Ma）相比花柱較長(zhǎng)（圖1I），且雄蕊較短（圖1J、K）。

表1 雄性不育系09-05A與冬榨菜歐新A主要農(nóng)藝性狀比較Table 1 Comparison of main agronomic traits between cytoplasmic male sterility system(CMS)09-05A and oxa A transferred in winter stem mustard

圖1 花器官形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Morphological observation of flower organs

2.2 不育系09-05A花粉粒形態(tài)和花粉活動(dòng)

對(duì)不育系09-05A及其保持系成熟花粉粒進(jìn)行掃描電鏡觀察（圖2）發(fā)現(xiàn)，不育系09-05A花粉粒形態(tài)異常，萌發(fā)溝塌陷。利用FDA對(duì)成熟花粉粒進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)：保持系的花粉粒在藍(lán)光激發(fā)下能夠發(fā)出熒光（圖3A、C），花粉粒表現(xiàn)出具有生活力；而不育系09-05A的花粉粒在藍(lán)光激發(fā)下未能檢測(cè)到熒光信號(hào)（圖3E、G），花粉粒沒有生活力。利用DAPI對(duì)成熟花粉粒進(jìn)行染色，可以清楚地看到保持系成熟花粉粒細(xì)胞的3個(gè)細(xì)胞核（圖4A），而在不育系09-05A中未觀察到花粉粒細(xì)胞核熒光信號(hào)（圖4C）。

圖2 花粉粒掃描電鏡觀察Fig.2 Scanning electron microscopy(SEM)observation of pollen grains

圖3 花粉粒生活力觀察Fig.3 Observation on viability of pollen grains

圖4 花粉粒細(xì)胞核DAPI染色觀察Fig.4 DAPI staining observation of pollen grain nucleus

2.3 不育系09-05A花藥橫切面觀察結(jié)果

為了進(jìn)一步明確不育系09-05A花粉敗育的發(fā)生時(shí)期，本研究參照擬南芥不同花藥發(fā)育時(shí)期劃分標(biāo)準(zhǔn)[14]，觀察了不同發(fā)育時(shí)期09-05A的花藥橫切半薄切片。結(jié)果表明：保持系和不育系都能正常形成四分體（圖5A、F）；保持系小孢子從四分體中釋放出來后，形成形狀不規(guī)則、無細(xì)胞壁的單核細(xì)胞（圖5B）；隨著花粉發(fā)育進(jìn)程的進(jìn)行，保持系小孢子細(xì)胞內(nèi)逐漸產(chǎn)生一些液泡，細(xì)胞壁開始形成，最終形成圓形、細(xì)胞核靠邊、擁有大液泡的單核細(xì)胞（圖5C、D）；類似REGAN等的研究[15]，隨后小孢子對(duì)液泡進(jìn)行再吸收，緊接著進(jìn)行第一次有絲分裂（圖5E）；小孢子經(jīng)過2次有絲分裂之后形成擁有3個(gè)細(xì)胞核的細(xì)胞（數(shù)據(jù)未顯示）。不育系09-05A的小孢子同樣能夠從四分體中正常釋放出來，形成形狀不規(guī)則、無細(xì)胞壁的單核細(xì)胞（圖5G）；然而，隨著小孢子液泡化程度的進(jìn)行，不育系09-05A的花藥室內(nèi)逐漸開始出現(xiàn)異常形態(tài)的小孢子，這些小孢子不能被二甲基藍(lán)染料正常著色，細(xì)胞內(nèi)的部分內(nèi)含物丟失（圖5H、I）；當(dāng)小孢子發(fā)育至有絲分裂時(shí)期時(shí)，不育系09-05A花藥室內(nèi)異常形態(tài)的小孢子達(dá)到100%（圖5J）。

2.4 不育系09-05A小孢子橫切面觀察結(jié)果

圖5 花藥橫切面觀察Fig.5 Transverse section observation of anthers

進(jìn)一步利用超薄透射電鏡對(duì)小孢子橫切面進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)：在小孢子液泡化早期，保持系小孢子細(xì)胞核及各類細(xì)胞器清晰可見，液泡開始出現(xiàn)并散落在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞壁和表面覆蓋物已形成（圖6A）；隨著小孢子進(jìn)入液泡化時(shí)期，液泡數(shù)量變少，體積變大，一個(gè)大液泡明顯清晰地分布在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核被液泡擠至細(xì)胞邊緣（圖6C）；隨后，小孢子進(jìn)入有絲分裂時(shí)期，大液泡消失（圖6E）。不育系09-05A的小孢子在液泡化早期細(xì)胞壁和表面覆蓋物發(fā)育完全，萌發(fā)溝正常，但細(xì)胞質(zhì)逐漸開始出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為液泡體積不斷增大，細(xì)胞核、細(xì)胞器等細(xì)胞內(nèi)含物逐漸降解（圖6B、D）；當(dāng)小孢子發(fā)育進(jìn)入有絲分裂時(shí)期，小孢子細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞器等內(nèi)含物基本完全降解，只剩下殘留的碎片，細(xì)胞壁覆蓋物脫落，萌發(fā)溝處發(fā)生不正常內(nèi)陷和折疊，細(xì)胞成空癟、畸形狀態(tài)（圖6F）。

3 討論

細(xì)胞質(zhì)雄性不育是廣泛存在于高等植物中的母性遺傳現(xiàn)象，是核基因、細(xì)胞器基因和生長(zhǎng)代謝等因素綜合作用的結(jié)果。其中，核基因起主要作用，線粒體在腺苷三磷酸（ATP）供應(yīng)、電子傳遞、蛋白質(zhì)翻譯等代謝過程中起著至關(guān)重要的作用[16]。研究表明，基于線粒體特異基因的分子標(biāo)記是鑒定不同類型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的一種有效手段[17]。HENG等[18]根據(jù)目前已報(bào)道的十字花科作物雄性不育系不育基因的保守序列設(shè)計(jì)線粒體特異基因分子標(biāo)記，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）發(fā)現(xiàn)，在冬榨菜歐新A不育系及其保持系中未檢測(cè)到這些細(xì)胞質(zhì)特異性分子標(biāo)記，表明歐新A不育系與其他報(bào)道的十字花科細(xì)胞質(zhì)雄性不育系（包括ogu CMS、nap CMS、tour CMS、pol CMS、hau CMS、Moricandia arvensis CMS、orf220 CMS）不同，是一種新型的細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型。

圖6 小孢子橫切面觀察Fig.6 Transverse section observation of microspores

花粉敗育是細(xì)胞質(zhì)雄性不育的主要表現(xiàn)型，不同類型的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系其花藥發(fā)育的敗育時(shí)期和特征也各不相同。研究發(fā)現(xiàn)，ogu CMS花粉敗育發(fā)生在小孢子四分體至單核花粉期，不育系的絨氈層細(xì)胞畸形，表明其敗育與絨氈層的不正常發(fā)育有關(guān)[19]。胡永敏等[20]對(duì)多種甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，pol和nap CMS小孢子敗育時(shí)期為孢原細(xì)胞時(shí)期，不能進(jìn)行造孢細(xì)胞和壁細(xì)胞的分化。鄒瑞昌等[21]將油菜hau CMS轉(zhuǎn)育到葉用芥菜中研究發(fā)現(xiàn)：不育系花藥發(fā)育部分受阻于孢原細(xì)胞分化期，不能正常行成花粉囊；部分受阻于花粉母細(xì)胞時(shí)期至單核小孢子時(shí)期，花粉母細(xì)胞雖能正常進(jìn)行減數(shù)分裂，但發(fā)育到四分體時(shí)期或單核時(shí)期時(shí)細(xì)胞解體。HENG等[18]研究發(fā)現(xiàn)，將油菜歐新A雄性不育系轉(zhuǎn)育至冬榨菜，不育系花粉敗育發(fā)生在單核細(xì)胞晚期，小孢子呈現(xiàn)液泡化，至花粉成熟時(shí)期，導(dǎo)致花粉完全敗育。以上研究表明，在不同遺傳背景下不同CMS花藥在發(fā)育過程中表現(xiàn)的敗育時(shí)期和細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)不同。

研究表明，相同不育源轉(zhuǎn)育到不同物種中，CMS表現(xiàn)型會(huì)表現(xiàn)出差異[22]。本研究通過對(duì)春榨菜雄性不育系09-05A的花器官進(jìn)行形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，該不育系表現(xiàn)出的柱頭蕾期外露、雄蕊顯著縮短等生物學(xué)性狀與冬榨菜歐新A雄性不育系[18]基本相同。通過對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的花藥和小孢子橫切面觀察和進(jìn)一步深入分析發(fā)現(xiàn)：春榨菜雄性不育系09-05A花粉發(fā)育從單核小孢子中期（即小孢子液泡化早期）開始出現(xiàn)紊亂，稍早于冬榨菜歐新A雄性不育系花粉敗育時(shí)期（單核小孢子晚期）；隨著花粉發(fā)育的進(jìn)行，不育系09-05A小孢子液泡化程度增加，同時(shí)細(xì)胞核、細(xì)胞器等物質(zhì)逐漸降解，至小孢子有絲分裂時(shí)期，已表現(xiàn)出100%的畸形和空癟，花粉敗育持續(xù)時(shí)間略短于冬榨菜歐新A雄性不育系。以上差異可能與物種間不同生態(tài)類型差異有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)春榨菜雄性不育系09-05A的花器官進(jìn)行形態(tài)觀察、花粉育性進(jìn)行鑒定及不同發(fā)育時(shí)期的花藥和小孢子橫切面進(jìn)行深入分析研究發(fā)現(xiàn)：不育系09-05A的花器官表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)性異常，主要表現(xiàn)為蕾期花柱外露，雄蕊縮短；花粉粒沒有生活力，高度不育；花粉發(fā)育在小孢子液泡化早期開始出現(xiàn)紊亂，至花粉有絲分裂時(shí)期表現(xiàn)出100%敗育，細(xì)胞呈現(xiàn)出畸形、空癟、不完整等表現(xiàn)型。結(jié)合細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果，推測(cè)小孢子細(xì)胞非正常液泡化是導(dǎo)致花粉敗育的原因。與冬榨菜歐新A雄性不育系花藥發(fā)育過程中表現(xiàn)的敗育時(shí)期和細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，二者在花粉敗育時(shí)期和過程等方面略有不同，說明同一不育源轉(zhuǎn)育至不同生態(tài)類型品種的雄性不育系細(xì)胞學(xué)特性可能會(huì)產(chǎn)生一定的差異。本研究為深入進(jìn)行榨菜雄性不育的發(fā)育機(jī)制研究和春榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育的雜種優(yōu)勢(shì)利用奠定了一定的基礎(chǔ)，還有待進(jìn)一步深入進(jìn)行相關(guān)不育基因的鑒定和研究。

致謝 重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供了“榨菜歐新A”不育源，并對(duì)本科研工作予以了大力支持，謹(jǐn)致謝意！

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