曹卓洋，呂清華，謝媛，方萍，*，汪榮才，葉達豐

（1.浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，污染環(huán)境修復(fù)與生態(tài)健康教育部重點實驗室，杭州310058；2.浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，浙江省亞熱帶土壤與

植物營養(yǎng)重點研究實驗室，杭州310058；3.寧波綠興農(nóng)業(yè)科技有限公司，浙江慈溪315300）

獺兔是一種典型的皮用兔，既可以提供珍貴裘皮，又可以提供優(yōu)質(zhì)兔肉。我國是世界獺兔養(yǎng)殖大國，獺兔皮、肉的產(chǎn)量和銷量居世界首位。由于幼兔免疫力較差，消化能力有限，很容易引起腹脹和腹瀉，甚至死亡[1]，所以，提高幼兔免疫力是降低其死亡率的重要途徑。冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）是鱗翅目蝙蝠蛾科蝠蛾屬幼蟲被麥角科真菌中國被毛孢（Hirsutella sinensis）寄生所形成的蟲菌復(fù)合體，其營養(yǎng)豐富，含有10多種氨基酸、多種肽類及蟲草素、甘露醇、多糖等生物活性物質(zhì)，具有增強免疫力的功能[2]。由于冬蟲夏草菌寄生性苛刻，其寄主蝠蛾屬昆蟲的生境獨特，主要分布在我國青藏高原等海拔3 500～5 000 m的高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)區(qū)，蝠蛾完成1個生命周期通常需要3～4年，所以冬蟲夏草天然資源十分稀少[3]。目前利用冬蟲夏草無性型即麥角科真菌中國被毛孢[4]或伴生菌蝙蝠蛾擬青霉（Paecilomyces hepiali）等通過深層液體發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體產(chǎn)品作為天然冬蟲夏草的人工替代品已廣泛用于保健食品中。鑒于此，能否利用液體發(fā)酵制備的冬蟲夏草菌絲體液作為獺兔飼料添加劑，以提高獺兔幼仔的免疫力，從而降低死亡率，值得探討。為此，本文對孕期及哺乳期母兔及其仔兔進行日糧中添加冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液的喂飼試驗，通過測定斷奶幼仔的單窩存活率、整窩死亡率、免疫球蛋白數(shù)量、淋巴細胞陽性率、免疫器官指數(shù)等指標，以考察冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液作為飼料添加劑對母兔產(chǎn)仔成活率以及對仔兔在斷奶應(yīng)激情況下免疫功能的影響，為家畜綠色飼料添加劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

冬蟲夏草菌種購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏號為ACCC50542。

基礎(chǔ)日糧配方：玉米13%、麩皮20%、豆粕15%、苜蓿草粉8%、麥芽根5%、草粉35%、復(fù)合預(yù)混料4%。改良日糧配方：在基礎(chǔ)日糧中添加2%冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose medium,PDA）：200 g土豆切成小塊，加1 000 mL水于鍋內(nèi)，加熱至沸騰，持續(xù)煮沸20～30 min，經(jīng)紗布過濾至1 000 mL燒杯中，加葡萄糖20 g，補充水分到1 000 mL，分裝于500 mL鹽水瓶，300 mL/瓶，在121.3℃下滅菌30 min，冷卻后備用。

PDA平板：在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂粉，同上滅菌后冷卻至45℃左右，倒入無菌培養(yǎng)皿，得PDA平板。

1.3 冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液制備

在無菌環(huán)境中，挑取冬蟲夏草菌斜面菌苔接種于PDA平板，在20℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，挑取活化菌苔接種于PDA液體培養(yǎng)基，于20℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)7 d，得冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液，備用。

1.4 試驗設(shè)計

獺兔喂飼試驗在寧波綠興農(nóng)業(yè)科技有限公司進行。

1.4.1 孕期及哺乳期母兔喂飼試驗

將80只體質(zhì)量相近且剛配種的同期懷孕母兔隨機分為2組，每組40只。對照組喂飼基礎(chǔ)日糧，試驗組喂飼改良日糧。試驗從配種受孕開始至仔兔斷奶結(jié)束。期間記錄母兔產(chǎn)仔數(shù)、斷乳仔兔存活率，測定哺乳期母兔免疫球蛋白含量。

1.4.2 斷奶仔兔喂飼試驗

從上述母兔喂飼的試驗組所產(chǎn)仔兔中選取體質(zhì)量相近的斷奶仔兔10只，喂飼改良日糧（試驗組Ⅰ）。從母兔喂飼試驗的對照組所產(chǎn)仔兔中選取體質(zhì)量相近的斷奶仔兔20只，隨機分為2組：一組喂飼基礎(chǔ)日糧（對照組），另一組喂飼改良日糧（試驗組Ⅱ）。飼養(yǎng)35 d后，測定供試仔兔的免疫器官指數(shù)和T淋巴細胞陽性率。

1.5 測定項目

1.5.1 存活率測定

記錄供試母兔產(chǎn)仔數(shù)、斷奶期仔兔存活數(shù)，計算斷奶期仔兔單窩存活率和整窩死亡率。

1.5.2 免疫球蛋白的測定

在母兔喂飼試驗中，隨機取試驗組和對照組哺乳期母兔各5只，禁食12 h，用采血器采血3 mL，保存于0℃下，備用。采用間接酶聯(lián)免疫吸附法測定免疫球蛋白A（immunoglobulin A,IgA）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）的含量。

1.5.3 免疫器官指數(shù)測定

在仔兔喂飼試驗中，隨機取試驗組Ⅰ、試驗組Ⅱ和對照組仔兔各3只，禁食12 h，用采血器采血3 mL，保存于0℃下，備用。仔兔采血后頸動脈放血致死，解剖，取蚓突、胸腺、脾、圓小囊4種免疫器官，剔去脂肪稱量，計算免疫器官指數(shù)：

免疫器官指數(shù)=器官質(zhì)量/mg÷活體質(zhì)量/g。

1.5.4 T淋巴細胞陽性率

采用α-醋酸萘酯酶（α-acidalpha naphthyl aetate esterase,ANAE）法[5-7]測定仔兔喂飼試驗中試驗組Ⅰ、試驗組Ⅱ和對照組血樣的T淋巴細胞陽性率，具體步驟如下：取血液推片，晾干，用福爾馬林-丙酮緩沖液（pH=6.6）在4℃條件下固定1.5 min，流水沖洗3 min，再用蒸餾水沖洗，空氣中干燥至少3 min；將血涂片浸入孵育液中，在37℃水浴箱內(nèi)孵育3 h，自來水沖洗3 min，再用蒸餾水略洗；用1%甲基綠溶液染色15 min，自來水洗去多余染液，在空氣中干燥。油鏡檢查200個淋巴細胞，胞質(zhì)中出現(xiàn)紅色反應(yīng)產(chǎn)物者為ANAE陽性。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Excel 2010整理試驗數(shù)據(jù)并作圖；采用DPS 16.05軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 斷奶仔兔成活狀況比較

由表1可見：試驗組和對照組各40只供試受孕母兔中分別有29只和24只產(chǎn)仔，平均單窩產(chǎn)仔數(shù)分別為4.7只與4.1只，經(jīng)t檢驗表明，兩者并無明顯差異（P=0.22）；而試驗組的斷奶仔兔單窩成活率顯著高于對照組28個百分點（P=0.02）。表2顯示，斷奶仔兔整窩成活率或部分成活率在試驗組與對照組間均無顯著差異（P=0.34或0.29），而試驗組斷奶仔兔的整窩死亡比率低于對照組33.5個百分點（P=0.02）。上述結(jié)果表明，母兔孕期與哺乳期喂飼添加冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液的改良日糧可明顯提高斷奶期仔兔的單窩成活率，顯著降低整窩死亡率。

2.2 哺乳期母兔免疫球蛋白含量比較

哺乳期母兔的IgA與IgG含量如表3所示。其中試驗組的IgA含量顯著高于對照組（P＜0.01），而IgG含量在兩組間未見顯著差異（P＞0.05）。

表1 不同處理單窩產(chǎn)仔數(shù)及斷奶仔兔成活率比較Table 1 Comparison of cub numbers and survival rate of weaning rabbits per mother rabbit between treatments

表2 不同處理斷奶仔兔整窩成活狀況比較Table 2 Comparison of weaning rabbit survival conditions of whole nest between treatments

表3 不同處理哺乳期母兔免疫球蛋白含量比較Table 3 Comparison of immune globulin content of mother rabbits in lactation between treatments

相同小寫字母表示在P＜0.05水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義；不同大寫字母表示在P＜0.01水平差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義。

The same lowercase letter indicates no significant difference at the 0.05 probability level;different uppercase letters indicate highly significant difference at the 0.01 probability level.

2.3 斷奶仔兔T淋巴細胞陽性率比較

仔兔喂飼試驗中各組T淋巴細胞陽性率如圖1所示。試驗組Ⅰ和Ⅱ的T淋巴細胞陽性率均顯著高于對照組（P＜0.01），而試驗組Ⅰ顯著高于試驗組Ⅱ。

2.4 斷奶仔兔免疫器官指數(shù)比較

由表4可知：試驗組Ⅰ和Ⅱ的蚓突指數(shù)顯著高于對照組（P＜0.01），而試驗組Ⅰ與Ⅱ之間未見顯著差異；從數(shù)據(jù)上看，除胸腺指數(shù)外，試驗組Ⅰ和Ⅱ各項器官指數(shù)均高于對照組，但差異未達顯著水平（P＞0.05）。

圖1 仔兔喂飼試驗中不同處理的T淋巴細胞陽性率比較Fig.1 Comparison of positive T lymphocyte rate of young rabbits in different treatments

3 討論

從初生到斷奶階段的小兔稱為仔兔，從斷奶至75日齡的小兔稱為幼兔。這2個階段的兔因其生命力和消化機能較弱，抗病力差，容易發(fā)生消化系統(tǒng)疾病，如果飼養(yǎng)不善，則死亡率較高，有的高達60%～70%[8]。喂飼添加冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液的改良日糧后，懷孕母體產(chǎn)仔數(shù)有所提高，仔兔的存活率顯著高于對照組，這在一定程度上反映了仔兔抗病能力的增強。其可能原因是冬蟲夏草菌絲體含有蟲草素等增強免疫以及抗病能力的有效成分，其機制有待進一步研究。

表4 冬蟲夏草對仔兔免疫器官指數(shù)的影響Table 4 Effects of Cordyceps sinensis on the immune organ index of young rabbits

脾、胸腺、蚓突、圓小囊是兔的重要免疫器官。一般認為，免疫器官質(zhì)量增加是免疫增強的表現(xiàn)[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，在仔兔日糧中添加冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液可以顯著提高仔兔蚓突指數(shù)，并且喂飼改良日糧的仔兔器官發(fā)育更快更大，說明冬蟲夏草菌絲體可以促進仔兔免疫器官綜合發(fā)育，促進機體免疫機能成熟，這也許是該添加劑提高仔兔免疫能力的途徑之一。

本文采用α-醋酸萘酯酶（ANAE）反應(yīng)試驗測定了T淋巴細胞中的酯酶，結(jié)果表明，試驗組顯著高于對照組。而ANAE陽性淋巴細胞率反映了成熟T淋巴細胞的含量，代表了機體細胞免疫水平。說明冬蟲夏草的有效成分可能通過促進T淋巴細胞的成熟來提高免疫水平，其機制尚不明確。

免疫球蛋白是動物受到抗原刺激后，體內(nèi)產(chǎn)生的一類能與抗原特異性相互作用的球蛋白。IgG和IgA是仔兔體內(nèi)2種重要的免疫球蛋白。其中：IgG是生物體液內(nèi)主要的免疫球蛋白，是機體抗感染免疫的主力抗體[11-12]；IgA在血清中的含量僅次于IgG，占血清免疫球蛋白總量的10%～20%，在抵抗病原入侵方面極其重要[13]。本研究中，在懷孕母兔的日糧中添加冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液能顯著提高IgA的含量，這也可能是該添加劑通過增強體液免疫功能來提高懷孕母兔的免疫水平。

綜上所述，對孕期及哺乳期母兔喂飼添加冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液的改良日糧，有利于降低仔兔死亡率、提高母兔IgA含量，對斷乳幼兔喂飼改良日糧有利于提高免疫器官質(zhì)量和T淋巴細胞陽性率。由此可見，冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液作為飼料添加劑是一種很好的免疫增強劑，能在一定程度上促進仔兔的免疫器官發(fā)育，提高仔兔免疫水平。而且冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液純天然，無耐藥性、無毒副作用，是一款綠色、環(huán)保、無害、高效的免疫增強劑，在一定程度上可以減少抗生素的濫用，對我國實施健康綠色生態(tài)養(yǎng)殖具有積極的意義。

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