“基因—體質(zhì)—疾病”關(guān)聯(lián)模式下4種中醫(yī)體質(zhì)差異表達(dá)基因富集分析

孫占東 劉嘉 曾慶琪

摘要：目的 從系統(tǒng)生物學(xué)角度挖掘基因與4種中醫(yī)體質(zhì)（濕熱質(zhì)、血瘀質(zhì)、特稟質(zhì)、痰濕質(zhì)）的相關(guān)性，探究體質(zhì)形成及體病相關(guān)的微觀機(jī)理，為體質(zhì)分類及體病相關(guān)理論提供生物學(xué)依據(jù)。方法 計(jì)算機(jī)檢索中國(guó)知識(shí)資源總庫(kù)（CNKI）、中國(guó)學(xué)術(shù)期刊數(shù)據(jù)庫(kù)（萬(wàn)方數(shù)據(jù)）建庫(kù)至2016年12月31日收錄的中醫(yī)體質(zhì)與基因表達(dá)相關(guān)文獻(xiàn)。收集4種中醫(yī)體質(zhì)的差異表達(dá)基因，分別采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行富集分析，包括基因組織富集分析、疾病分析、GO分析及通路分析。對(duì)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果進(jìn)行下載整理。結(jié)果 4種中醫(yī)體質(zhì)在基因?qū)哟紊洗嬖谳^大差異，每種體質(zhì)顯著富集的基因功能、活性、通路、相關(guān)疾病、表達(dá)位置等均有特異性?；虮磉_(dá)模式不同，導(dǎo)致體質(zhì)對(duì)疾病易感性及傾向性的差異。結(jié)論 本研究提示中醫(yī)體質(zhì)形成的實(shí)質(zhì)是基因表達(dá)模式的差異，病理變化由其改變所致。

關(guān)鍵詞：中醫(yī)體質(zhì)；體病相關(guān)；基因；富集分析

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.022

中圖分類號(hào)：R2-05；R229 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）09-0091-05

Abstract： Objective To dig the correlation between genes and four TCM constitutions （phlegm-dampness， blood stasis， allergy， and dampness-heat）； To analyze microscopic mechanism of constitution formed and constitution-disease correlation； To provide biological basis for TCM constitution classification and constitution-disease correlation theory. Methods Literature about TCM constitutions and gene expressions in CNKI and Wanfang Database were retrieved by computers from the establishment of database to 31， December 2016. Differentially expressed genes of four TCM constitutions were collected， and DAVID database was used for enrichment analysis， including gene tissue enrichment analysis， disease analysis， GO analysis， and pathway analysis. The results of DAVID database analysis were downloaded and analyzed. Results Four TCM constitutions had differences in gene level， and each constitution had the specificity in significantly enriched gene function， activity， pathways， related diseases， and expression locations. Different patterns of gene expression led to the constitution differences in disease susceptibility and tendency. Conclusion The essence of TCM constitution formation is the change of gene expression patterns， and the pathological changes are also caused by the change.

Keywords： TCM constitutions； constitution-disease correlation； gene； enrichment analysis

隨著人類疾病譜的變化，其復(fù)雜性、多樣性促使個(gè)體化醫(yī)療模式成為新浪潮。中醫(yī)體質(zhì)學(xué)說(shuō)是以研究人類各個(gè)體質(zhì)特征，以個(gè)體為對(duì)象，指導(dǎo)疾病的預(yù)防、治療以及養(yǎng)生康復(fù)的中醫(yī)基礎(chǔ)理論，與個(gè)體化醫(yī)療模式密切相關(guān)。王琦[1]提出的體質(zhì)九分法被普遍認(rèn)可。體質(zhì)形成的微觀機(jī)制是中醫(yī)體質(zhì)學(xué)研究必須面臨的科學(xué)問(wèn)題[2]。體質(zhì)的形成具備個(gè)體性的物質(zhì)基礎(chǔ)，每種體質(zhì)都有其特定的基因表達(dá)模式，體質(zhì)宏觀的差異應(yīng)源于微觀基因表達(dá)的差異[3]。因此，從分子水平探究體質(zhì)形成的生物學(xué)機(jī)理十分必要。

目前中醫(yī)體質(zhì)的基因組學(xué)研究表明，各種偏頗質(zhì)在基因表達(dá)上普遍存在失調(diào)[4]。基因直接或間接決定了中醫(yī)體質(zhì)對(duì)某些病癥種類的易罹性及傾向性，從而導(dǎo)致個(gè)體在病性、病位、病程、病變等方面的差異[5]。通過(guò)研究體質(zhì)的基因表達(dá)基礎(chǔ)，即體質(zhì)與基因、基因與疾病的相關(guān)性，預(yù)測(cè)體質(zhì)與疾病的相關(guān)性，可為中醫(yī)體質(zhì)學(xué)“體病相關(guān)”理論提供生物學(xué)依據(jù)。

基因功能富集分析又稱為功能聚類分析，其原理為超幾何分布，最終獲得一組基因集在某個(gè)功能分類中的顯著性條目，這些條目是與實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠酗@著關(guān)聯(lián)的、靶向性的基因功能類別，即導(dǎo)致樣本差異最重要的功能信息[6]。本研究整合4種體質(zhì)（濕熱質(zhì)、血瘀質(zhì)、特稟質(zhì)、痰濕質(zhì)）的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，采用系統(tǒng)生物學(xué)方法，對(duì)各體質(zhì)的差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析。以期從分子水平闡述中醫(yī)體質(zhì)易感疾病的原因、性質(zhì)、部位及其內(nèi)在聯(lián)系，為調(diào)體防病提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源及篩選

計(jì)算機(jī)檢索中國(guó)知識(shí)資源總庫(kù)（CNKI）、中國(guó)學(xué)術(shù)期刊數(shù)據(jù)庫(kù)（萬(wàn)方數(shù)據(jù)），以主題詞“體質(zhì)”“基因表達(dá)譜”進(jìn)行模糊檢索，檢索范圍均從建庫(kù)至2016年12月31日。對(duì)結(jié)果逐一仔細(xì)閱讀，同時(shí)滿足下列標(biāo)準(zhǔn)予納入：①實(shí)驗(yàn)樣本符合9種體質(zhì)分類及判定標(biāo)準(zhǔn)[1]。②以偏頗體質(zhì)為實(shí)驗(yàn)樣本，平和體質(zhì)為對(duì)照樣本，樣本量不小于3。③取樣于人體外周血液且應(yīng)用芯片技術(shù)檢測(cè)基因表達(dá)譜。④文獻(xiàn)結(jié)果中明確報(bào)道偏頗質(zhì)相對(duì)于平和質(zhì)樣本的差異表達(dá)基因。

1.2 數(shù)據(jù)提取

對(duì)文獻(xiàn)中4種偏頗體質(zhì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行提取收集，以基因列表（gene list）形式分別保存于獨(dú)立的文本文件中，基因列表格式：gene1，gene2，gene3...。如某種體質(zhì)差異表達(dá)基因結(jié)果在文獻(xiàn)中以芯片ID形式報(bào)道，需對(duì)芯片ID進(jìn)行轉(zhuǎn)換，找出該芯片參考資料，將芯片ID轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的正式基因符（official gene symbol），如ID（211300_s_at）→gene symbol（TP53）。最后對(duì)所獲得的每種體質(zhì)差異表達(dá)基因去冗處理。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)收集的4種體質(zhì)差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析。DAVID為生物信息整合數(shù)據(jù)庫(kù)，知識(shí)庫(kù)豐富且易操作，可對(duì)輸入的基因集進(jìn)行“一鍵式”系統(tǒng)綜合的生物功能注釋分析，目前被引用超過(guò)26 000次。將提取的基因列表文件輸入數(shù)據(jù)庫(kù)，在輸出結(jié)果中可直接獲得體質(zhì)差異表達(dá)基因的組織、疾病、GO（gene ontology）、生物通路等富集信息，其輸出結(jié)果可另存為文本格式。對(duì)下載結(jié)果進(jìn)一步篩選，當(dāng)P<0.05時(shí)，富集結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，被作為該種體質(zhì)顯著性的富集條目[7]。利用數(shù)據(jù)庫(kù)集成的分析功能，可明確基因功能、特性、表達(dá)位置等信息。

組織富集分析。對(duì)于給定的體質(zhì)差異表達(dá)基因集，組織富集分析可快速識(shí)別其在人體組織中顯著表達(dá)的位置，用于分析細(xì)胞、組織、器官與體質(zhì)癥候表現(xiàn)的關(guān)系。

疾病富集分析?；贠MIM數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的人類遺傳疾病基因，將體質(zhì)差異表達(dá)基因集作為輸入數(shù)據(jù)，通過(guò)疾病富集分析可獲得對(duì)應(yīng)的疾病信息，為進(jìn)一步體病相關(guān)研究提供依據(jù)。

GO富集分析。GO富集分析分為“molecular function”（分子功能）、“biological process”（生物過(guò)程）、“cellular component”（細(xì)胞組成）3部分，通過(guò)該項(xiàng)分析可找出在統(tǒng)計(jì)上顯著富集的GO條目，尋找影響體質(zhì)形成的基因功能。

生物通路富集分析。利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取體質(zhì)差異表達(dá)基因參與的生物通路，分析生物通路的功能與體質(zhì)形成的相關(guān)性，探究體質(zhì)形成的微觀機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 中醫(yī)體質(zhì)差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)

經(jīng)檢索，獲得文獻(xiàn)CNKI 107篇、萬(wàn)方數(shù)據(jù)195篇。閱讀篩選后，進(jìn)行4種體質(zhì)差異基因數(shù)據(jù)提取、整理，獲得4種中醫(yī)體質(zhì)差異表達(dá)基因集、文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1。

2.2 4種中醫(yī)體質(zhì)差異表達(dá)基因組織富集分析

組織富集可對(duì)基因表達(dá)位置進(jìn)行定位研究，分析細(xì)胞、組織、器官與體質(zhì)癥候表現(xiàn)的關(guān)系。4種中醫(yī)體質(zhì)差異表達(dá)基因在人體分布位置存在較大差異。特稟質(zhì)差異表達(dá)基因富集范圍較廣，多分布于脾臟、外周血淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、血小板等免疫及血液系統(tǒng)，及肝臟、卵巢、胰腺等臟器。濕熱質(zhì)差異表達(dá)基因分布于口腔、肝臟、骨髓、肺等部位，在白細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞中也存在。痰濕質(zhì)差異表達(dá)基因的分布多與生殖器官相關(guān)，如子宮、卵巢、胎盤，在上皮細(xì)胞與淋巴細(xì)胞中也有分布。血瘀質(zhì)差異表達(dá)基因分布于骨髓、子宮、T細(xì)胞等。差異表達(dá)基因信息見圖1。

2.3 4種中醫(yī)體質(zhì)差異表達(dá)基因疾病富集分析

特稟體質(zhì)顯著富集得到13種疾病，其中8種為免疫系統(tǒng)疾病，2種與白血病相關(guān)；濕熱體質(zhì)富集得到13種疾?。庖呦到y(tǒng)疾病4種、腫瘤4種、口腔疾病2種及自然流產(chǎn)）；痰濕質(zhì)富集得到4種疾病（腫瘤2種、無(wú)精子癥及自身免疫性疾病）；血瘀質(zhì)富集得到2種疾?。ㄌ悄虿?、2型）。1型糖尿病被特稟質(zhì)、血瘀質(zhì)共同富集，HIV感染被特稟質(zhì)、濕熱質(zhì)共同富集。4種體質(zhì)差異表達(dá)基因疾病富集分析結(jié)果見圖2。

2.4 4種中醫(yī)體質(zhì)差異表達(dá)基因GO富集分析

差異表達(dá)基因GO富集分析在三個(gè)層次上得到顯著富集的注釋條目結(jié)果為：濕熱質(zhì)分子功能3條、生物過(guò)程21條、細(xì)胞組成12條；血瘀質(zhì)分子功能7條、生物過(guò)程6條、細(xì)胞組成5條；特稟質(zhì)分子功能7條、生物過(guò)程23條、細(xì)胞組成10條；痰濕質(zhì)分子功能5條、生物過(guò)程10條、細(xì)胞組成11條。每種體質(zhì)富集結(jié)果詳細(xì)注釋條目見圖3。

不同體質(zhì)差異表達(dá)基因在生物體內(nèi)功能、活性及表達(dá)位置不同，可能導(dǎo)致體質(zhì)差異。差異表達(dá)基因主要參與的生物過(guò)程方面，濕熱質(zhì)為防御真菌、細(xì)菌、病毒反應(yīng)、免疫反應(yīng)等，血瘀質(zhì)為細(xì)胞增殖、內(nèi)吞作用等，特稟質(zhì)為免疫反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK活性激活、炎癥反應(yīng)等，痰濕質(zhì)為正向調(diào)節(jié)I-kappab激酶/NF-kappaB信號(hào)、自噬、IL-1細(xì)胞反應(yīng)、IL-4負(fù)調(diào)控等。部分條目被多種體質(zhì)共同富集，如蛋白質(zhì)結(jié)合被特稟質(zhì)、痰濕質(zhì)、血瘀質(zhì)共同富集，蛋白激酶結(jié)合被特稟質(zhì)及血瘀質(zhì)共同富集，poly（A） RNA結(jié)合被痰濕質(zhì)、血瘀質(zhì)共同富集，表明多種體質(zhì)差異表達(dá)基因均參與重要的生物反應(yīng)過(guò)程，各體質(zhì)在組學(xué)層面存在內(nèi)部聯(lián)系，提示兼具多種體質(zhì)或體質(zhì)間轉(zhuǎn)化的可能。

2.5 4種中醫(yī)體質(zhì)差異表達(dá)基因生物通路富集分析

分析差異表達(dá)基因參與的生物通路，特稟質(zhì)富集得到7條生物通路，其中4條（系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗原處理和表達(dá)、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路）屬免疫系統(tǒng)，提示特稟質(zhì)免疫系統(tǒng)較平和質(zhì)增強(qiáng)。濕熱質(zhì)富集得到4條通路，其中2條屬免疫疾病通路、2條與細(xì)胞吞噬相關(guān)，也展示出免疫活性上調(diào)。痰濕質(zhì)富集得到4條通路，其中2條屬傳染性疾病通路，提示出炎癥反應(yīng)的亢進(jìn)，1條與鞘脂代謝相關(guān)，提示與脂類代謝疾病相關(guān)，1條為破骨細(xì)胞分化通路。血瘀質(zhì)富集得到3條通路，1條通路與腫瘤的膽堿代謝相關(guān)，1條通路屬磷脂酰肌醇信號(hào)通路，與鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，1條與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞能動(dòng)性有關(guān)。各體質(zhì)差異表達(dá)基因富集得到的條目不同，但在免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、代謝等方面均表現(xiàn)出較平和質(zhì)增強(qiáng)的趨勢(shì)，所得結(jié)果可能為富集生物通路與體質(zhì)特征的相關(guān)性及體質(zhì)形成的微觀機(jī)制，通路信息見圖4。

3 討論

中醫(yī)體質(zhì)學(xué)研究各體質(zhì)類型的生理、病理特點(diǎn)，分析疾病的反應(yīng)狀態(tài)、病變性質(zhì)和發(fā)展趨向，從而指導(dǎo)預(yù)防和治療。然而，中醫(yī)體質(zhì)形成的微觀機(jī)制尚不明確。本研究挖掘4種體質(zhì)具有的特異性遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，揭示不同體質(zhì)間的微觀基因表達(dá)差異。

特稟質(zhì)多與先天稟賦有關(guān)，也與后天失養(yǎng)相關(guān)，此類人群對(duì)外界環(huán)境適應(yīng)能力較差。本研究結(jié)果表明，特稟質(zhì)差異表達(dá)基因分布于免疫及血液系統(tǒng)，與免疫系統(tǒng)疾病高度相關(guān)，多參與免疫反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK活性激活、炎癥反應(yīng)等，與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗原處理和表達(dá)、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)等免疫系統(tǒng)通路相關(guān)。提示特稟質(zhì)與免疫系統(tǒng)和先天遺傳疾病關(guān)系密切，符合中醫(yī)理論。

濕熱質(zhì)因先天不足，久居濕地；或喜食肥甘，長(zhǎng)期飲酒，濕熱內(nèi)蘊(yùn)。此類人群周身乏力、面部痤瘡、口干口苦、便秘、尿短赤等。本研究結(jié)果表明，濕熱質(zhì)差異表達(dá)基因分布于口腔、肝、肺等易“上火”部位，與腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病及口腔病，防御真菌、細(xì)菌、病毒反應(yīng)，免疫反應(yīng)等密切相關(guān)。熱邪病位多變，其性上炎；濕邪重濁黏滯，其性趨下，故濕熱質(zhì)易罹患疾病復(fù)雜多樣，但主要涉及感染性疾病。

“肥人多痰濕”，痰濕質(zhì)常表現(xiàn)為嗜睡，喜食辛辣、肥甘厚膩，周身乏力、倦怠、身體沉重、大便黏膩等。本研究結(jié)果表明，痰濕質(zhì)差異表達(dá)基因分布多與生殖器官，腫瘤、無(wú)精子癥等，正向調(diào)節(jié)I-kappab激酶/NF-kappaB信號(hào)、自噬、IL-1細(xì)胞反應(yīng)、IL-4負(fù)調(diào)控等，脂類代謝疾病通路及炎癥通路有關(guān)。提示痰濕質(zhì)多與肥胖相關(guān)，符合中醫(yī)理論。

血瘀質(zhì)常因情志、飲食、勞逸等內(nèi)傷致血行不暢，或因外邪、內(nèi)傷、氣虛、邪熱迫血妄行，表現(xiàn)為面色青黯、疼痛、拒按、舌質(zhì)紫黯等。本研究結(jié)果表明，血瘀質(zhì)和腫瘤發(fā)病相關(guān)，與血瘀質(zhì)常致癥瘕積塊的中醫(yī)理論相符；血瘀質(zhì)出現(xiàn)磷脂酰肌醇信號(hào)通路變化，涉及鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)，提示與心腦血管疾病相關(guān)。疾病富集提示血瘀質(zhì)與糖尿病存在高度的體病相關(guān)性。

綜上，不同體質(zhì)的基因表達(dá)模式存在差異，易患疾病與體質(zhì)存在高度相關(guān)性。各體質(zhì)在基因?qū)哟斡幸欢?lián)系，提示兼夾體質(zhì)存在基因組學(xué)基礎(chǔ)。但本研究?jī)H收集了差異表達(dá)基因，未對(duì)體質(zhì)間相關(guān)性深入分析，后續(xù)可結(jié)合個(gè)體體質(zhì)特征及基因表達(dá)模式進(jìn)一步研究。中醫(yī)體質(zhì)以整體觀為基礎(chǔ)，系統(tǒng)生物學(xué)也以整體觀研究生命本質(zhì)。采用系統(tǒng)生物學(xué)方法，可對(duì)多種體質(zhì)在蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)方面開展研究，體內(nèi)的生命物質(zhì)如酶、細(xì)胞因子、代謝產(chǎn)物等，對(duì)體質(zhì)形成同樣發(fā)揮著重要作用，可進(jìn)一步印證體質(zhì)差異的客觀基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2017-06-26）

（修回日期：2017-07-27；編輯：向宇雁）