野生與種植黃連不同部位蛋白質(zhì)分析與評價

朱俊平 李龍 曾燕

摘要：目的 優(yōu)選黃連蛋白質(zhì)最佳提取方法，比較分析野生與種植黃連不同部位的蛋白質(zhì)差異。方法 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳和考馬斯亮藍法，以蛋白質(zhì)條帶豐度、蛋白質(zhì)相對分子量、每克樣品中蛋白質(zhì)含量為指標，比較3種提取方法（水提法、Tris-HCl法、硫酸銨沉降法）所得黃連蛋白質(zhì)的差異，并對野生與種植黃連不同部位蛋白質(zhì)的差異進行分析與評價。結(jié)果 優(yōu)選得出黃連蛋白質(zhì)最佳提取方法為Tris-HCl法，所得黃連蛋白質(zhì)豐度最高，且每克藥材中蛋白質(zhì)含量最高。野生與種植黃連不同部位的蛋白質(zhì)有明顯差異，蛋白質(zhì)豐度及每克藥材中蛋白質(zhì)含量均為：種植黃連根莖>野生黃連根莖>種植黃連莖葉>野生黃連莖葉>種植黃連須根。聚類分析結(jié)果顯示，野生與種植黃連根莖蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)關(guān)系較為顯著。結(jié)論 本研究優(yōu)選的Tris-HCl法可充分提取黃連中的蛋白質(zhì)；黃連根莖蛋白質(zhì)含量明顯高于其他部位。

關(guān)鍵詞：黃連；蛋白質(zhì)；聚丙烯酰胺凝膠電泳；考馬斯亮藍法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.015

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）09-0061-05

Abstract： Objective To optimize the extraction method of Coptidis Rhizoma protein； To compare and analyze the differences of protein in different parts of wild and cultivated Coptidis Rhizoma. Methods SDS-PAGE gel electrophoresis and Coomassie brilliant blue method were used to compare the differences of the protein of Coptis chinensis from the 3 extraction methods （water extraction， Tris-HCl and ammonium sulfate precipitation）， and the protein in different parts of the wild and cultivated Coptis chinensis， and analyzed and evaluated the differences. Results The optimum extraction method of Coptis chinensis protein is Tris-HCl method， and the protein content of Rhizoma Coptidis is the highest， and the content of protein is the highest in every gram of medicinal material. The differences among different parts of wild and cultivated Coptidis Rhizoma were obvious， and the ranks for protein abundance and protein content per gram were： rhizome of cultivated Coptis chinensis > rhizome of wild Coptis chinensis > stem and leaf of cultivated Coptis chinensis > stem and leaf of wild Rhizoma Coptidis > fibrous roots of cultivated Coptidis Rhizoma. Cluster analysis showed that the correlation between protein of wild and cultivated rhizome of Coptidis Rhizoma was obvious. Conclusion The optimum Tris-HCl method can extract the protein from Coptidis Rhizoma， and the protein content of roots of Coptidis Rhizoma is significantly higher than other parts.

Keywords： Coptidis Rhizoma； protein； SDS-PAGE； Coomassie brilliant blue method

植物類中藥的各種成分均為其原植物體的初級、次級代謝產(chǎn)物，這些代謝物都是沿生源代謝途徑生物合成而來[1]。如果把握了生源代謝途徑，不但可人為調(diào)節(jié)中藥成分含量高低、實現(xiàn)中藥質(zhì)量可控性，而且可以模擬體外仿生合成、實現(xiàn)中藥有效單體的可持續(xù)大批量獲得技術(shù)，解決名貴稀缺中藥資源短缺問題等[2-5]，因此，揭示中藥原植物體的生源代謝途徑具有重大的科學意義。欲揭示中藥中原植物生源代謝途徑，須先廓清中藥原植物中的總蛋白及酶系間、蛋白酶與成分間，以及蛋白與藥材部位間的關(guān)系。

黃連為毛茛科植物黃連、三角葉黃連或云連的干燥根莖[6]，主產(chǎn)于四川、湖南、貴州、陜西、湖北等地，具有清熱燥濕、清心除煩、瀉火解毒功效。黃連含有多種生物堿，主要成分為小檗堿，還有黃連堿、藥根堿、甲基黃連堿等[7]。因黃連產(chǎn)地分布較廣，炮制品種較多，質(zhì)量不易控制，目前采用HPLC、超高液相色譜法[8]、HPLC-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]測定主要生物堿評價黃連的內(nèi)在質(zhì)量。

隨著分子生物學的快速發(fā)展，分子鑒定技術(shù)越來越廣泛應(yīng)用于植物差異蛋白的比較[9-11]，但迄今利用差異蛋白質(zhì)鑒別藥用植物質(zhì)量鮮有報道。因此，本研究以黃連植株為對象，通過篩選次生代謝產(chǎn)物量高的重慶（種植）和湖南崀山（野生）的優(yōu)質(zhì)黃連，優(yōu)選黃連的蛋白提取方法，同時，采用蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）垂直電泳技術(shù)和聚類分析方法，分析野生與種植黃連不同部位的差異蛋白，以期建立黃連植物體中黃連小檗堿的生源代謝途徑，為確保優(yōu)質(zhì)藥材種植資源及質(zhì)量控制研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

TU-1900雙光束紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），EPS300電泳儀（Tanon），VE-180垂直電泳槽（Tanon），TS-A脫色搖床（金壇市中大儀器廠），EKUP-11-20T超純水機（長沙市科臨電子科技有限公司），IMS-40全自動雪花制冰機（常德市雪科電器有限公司），SB-5200 DTD型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司），H1850R臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），YP1002N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）。

新鮮黃連樣品為實地采集，野生黃連（未知年限黃連，多為單只，細瘦彎曲，狀如蝎尾）、種植黃連（6年生黃連，根狀莖黃色，微彎曲如蠶狀，具較長的“過橋”）均由湖南中醫(yī)藥大學石繼連教授鑒定為毛茛科黃連屬黃連Coptis chinensis Franch.。及時對鮮品黃連各部位進行前處理，將種植根莖、種植須根、種植莖葉、野生根莖、野生莖葉（野生黃連植株須根極短而少，故根莖和須根不進行分離）分別貯存于-80 ℃冰箱。

鹽酸小檗堿對照品（批號110713-200208），中國食品藥品檢定研究院；四甲基乙二胺（BR，批號20150930），國藥集團化學試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris，UP），Solarbio；1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.8），北京鼎國晶盛生物技術(shù)有限責任公司；1 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 6.8），Wellbioscience；β-Mercaptoethanol，Sigma；溴酚藍（Ind），國藥集團化學試劑有限公司；牛血清白蛋白（BR，98%），源葉生物；考馬斯亮藍G250（FMP），國藥集團化學試劑有限公司；丙烯酰胺、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉（SDS）、過硫酸銨、冰醋酸、磷酸、甲醇、50%戊二醛、氨水、95%乙醇、無水乙醇、甲醛溶液、甘油、甘氨酸、檸檬酸、硝酸銀、氫氧化鈉均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 電泳樣品緩沖液的制備

1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.8）0.5 mL，50%甘油0.4 mL，10%SDS 0.8 mL，β-Mercaptoethanol 0.2 mL，0.05%溴酚藍0.1 mL，超純水1.0 mL，混勻。

2.1.2 蛋白質(zhì)標準溶液的制備

精確稱取牛血清白蛋白10.0 mg，用超純水溶解后定容至100 mL，即得100 ?g/mL蛋白質(zhì)標準溶液，4 ℃冰箱保存[12]。

2.1.3 考馬斯亮藍染液的制備

精確稱取考馬斯亮藍G-250 100.0 mg，加入95%乙醇50 mL溶解，再加入85%磷酸100 mL，用蒸餾水定容至1000 mL，過濾，置于棕色試劑瓶中，備用[13]，最終溶液含0.01%考馬斯亮藍G-250、4.7%乙醇、8.5%磷酸。

2.2 不同部位植物總蛋白提取方法優(yōu)選

新鮮植物蛋白常用提取方法有水提法、Tris-HCl法、硫酸銨沉降法，分別用3種方法提取種植根莖、野生根莖，比較其提取黃連蛋白質(zhì)的優(yōu)劣。

2.2.1 蛋白質(zhì)提取

2.2.1.1 水提法

取新鮮植物體，剪碎，加6倍量超純水，冰水浴勻漿，超聲提取1.5 h，4 ℃離心，取上清液，加入等體積40%蔗糖溶液，混勻，于-20 ℃貯存[14]。

2.2.1.2 Tris-HCl法

取新鮮植物體，剪碎，于冰水浴研缽中加6倍量Tris-HCl緩沖液（pH 8.8）勻漿，冰水浴超聲提取1.5 h，4 ℃離心，取上清液，加入等體積40%蔗糖溶液，混勻，即得植物總蛋白提取液，于-20 ℃貯存[15]。

2.2.1.3 硫酸銨沉降法

取新鮮植物體，剪碎，于冰水浴研缽中加6倍量Tris-HCl緩沖液（pH 8.8）勻漿，冰水浴超聲提取1.5 h，4 ℃離心，取上清液，加固體硫酸銨至飽和度80%，靜置后于-20 ℃加入預(yù)冷的80%丙酮，-20 ℃過夜，離心，取沉淀，-20 ℃揮凈丙酮，Tris-HCl緩沖液（pH 8.8）溶解，于-20 ℃貯存[16]。

2.2.2 蛋白質(zhì)SDS-PAGE垂直電泳

試驗考察了8%、10%、12%、15%分離膠，3%、5%濃縮膠，60、80 V濃縮膠電壓，80、100、120、150 V分離膠電壓，10、15、20 ?L點樣量在SDS-PAGE中的電泳效果，最終選擇SDS-PAGE凝膠電泳條件為：12%分離膠與0.5 cm左右5%濃縮膠，垂直電泳槽在濃縮膠中電壓為80 V，進入分離膠電壓調(diào)至120 V，點樣量20 ?L。采用銀染色法染色，比較3種方法提取的種植根莖、野生根莖蛋白質(zhì)，結(jié)果見圖1。

SDS-PAGE結(jié)果顯示，不同提取方法對蛋白質(zhì)的提取、分離有很大影響，水提法、Tris-HCl法、硫酸銨沉降法均可得到一定量的蛋白質(zhì)，Tris-HCl法所得蛋白質(zhì)豐度最高、穩(wěn)定、清晰，水提法和硫酸銨沉降法所得蛋白質(zhì)濃度低且蛋白豐度較低。

2.2.3 考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量

2.2.3.1 標準曲線的繪制

分別取100 ?g/mL蛋白質(zhì)標準溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，各加考馬斯亮藍染液4 mL，并用超純水定容至10 mL，混勻，即得0、1、2、3、4、5、6 mg/L牛血清白蛋白標準品溶液[17]，用1號管進行700～500 nm全波長掃描，選定最大吸收波長595 nm，以0號管為空白對照，測定吸光度，繪制標準曲線，得回歸方程A=0.048 82C+0.016 48，r=0.999 1。

2.2.3.2 3種提取方法的蛋白質(zhì)含量測定

采用考馬斯亮藍法測定水提法、Tris-HCl法、硫酸銨沉降法所得蛋白質(zhì)含量，結(jié)果見表1?？梢姡?種提取方法對蛋白質(zhì)的提取量有很大差別，所提取蛋白質(zhì)的含量均為Tris-HCl法>水提法>硫酸銨沉降法，種植根莖和野生根莖均以Tris-HCl法提取所提取的植物總蛋白含量最高。因此，Tris-HCl法是提取黃連總蛋白的最佳方法。

2.3 黃連不同部位蛋白分析

2.3.1 電泳樣品制備

取種植根莖、種植須根、種植莖葉、野生根莖、野生莖葉，采用Tris-HCl法提取，分別制得植物總蛋白母液。分別取5種總蛋白母液500 ?L，各加入電泳樣品緩沖液100 ?L，混勻，于100 ℃水浴5 min，取出，放至室溫，即得野生與種植黃連不同部位蛋白電泳樣品。

2.3.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳

采用“2.2.2”項下優(yōu)選的SDS-PAGE電泳條件分析Tris-HCl法提取的野生與種植黃連不同部位（種植根莖、種植須根、種植莖葉、野生根莖、野生莖葉）蛋白電泳樣品在相對分子量分布上的差異，結(jié)果見圖2。

結(jié)果顯示，野生與種植黃連不同部位蛋白質(zhì)的相對分子量主要分布在34～10 kD。種植根莖在34～10 kD有3條多量蛋白質(zhì)，且在72～55 kD有1個蛋白條帶；種植須根僅在34～26 kD有1個較淺條帶；種植莖葉在34～10 kD有3條蛋白條帶，在72～55 kD有1個較淺蛋白條帶；野生根莖在34～17 kD有大量蛋白質(zhì)，在72～55 kD有1個較淺蛋白條帶；野生莖葉僅在34～26 kD有1個較深條帶。野生與種植黃連不同部位所含蛋白質(zhì)種類及蛋白質(zhì)含量差別明顯，蛋白質(zhì)條帶豐度為：種植根莖>野生根莖>種植莖葉>野生莖葉>種植須根。

2.3.3 總蛋白含量測定及聚類分析

分別取種植根莖、種植須根、種植莖葉、野生根莖、野生莖葉蛋白樣品溶液200 ?L，加入考馬斯亮藍染液4 mL，蒸餾水定容至10 mL，混勻，靜置15 min，在595 nm波長處測定吸光度，代入“2.2.3.1”項下標準曲線方程，并計算不同部位樣品蛋白質(zhì)含量。結(jié)果每克樣品中蛋白質(zhì)含量依次為：種植根莖（7.485 6±0.146 8）>野生根莖（6.310 3±0.138 1）>種植莖葉（4.061 7±0.158 9）>野生莖葉（3.013 6±0.156 2）>種植須根（2.255 4±0.173 9）。采用SPSS21.0軟件對結(jié)果數(shù)據(jù)進行聚類分析，見圖3?？梢灾庇^看出，野生與種植黃連根莖蛋白關(guān)聯(lián)關(guān)系較為顯著，與其他部位蛋白關(guān)聯(lián)不顯著。野生與種植黃連根莖的蛋白含量明顯高于其他部位，且6年生種植黃連根莖蛋白含量高于野生未知年限黃連根莖。

3 討論

蛋白質(zhì)的提取是蛋白質(zhì)組學研究的首要步驟，其提取蛋白的優(yōu)劣直接影響蛋白質(zhì)表達分析的研究及其結(jié)果的準確性。本試驗考察了3種常用的中藥材蛋白質(zhì)提取方法對野生與種植黃連蛋白提取濃度和豐度的影響，結(jié)果顯示，黃連蛋白提取濃度和豐度均為Tris-HCl法優(yōu)于水提法、硫酸銨沉降法，Tris-HCl法所提取的黃連蛋白條帶數(shù)目最多、條帶最清晰，每克樣品中蛋白質(zhì)含量最高，且操作步驟簡單，因此選擇Tris-HCl法作為黃連蛋白質(zhì)的提取方法。本試驗采用的SDS-PAGE和考馬斯亮藍法在蛋白亞基分布、相對分子量及蛋白質(zhì)定量時分析效率高、操作簡便、測定結(jié)果準確可靠，具有一定的可行性。

本試驗通過Tris-HCl法提取的野生與種植黃連根莖蛋白質(zhì)濃度和豐度比較顯示，6年生種植黃連根莖的蛋白質(zhì)濃度和豐度略高于野生未知年限黃連根莖。說明野生黃連的質(zhì)量不一定優(yōu)于種植黃連，也可能由于野生黃連為未知年限黃連，而種植黃連為6年生黃連，其有效成分含量差異受生長年限影響。

本試驗對黃連植株不同部位進行分離并對其蛋白質(zhì)進行分析和評價。種植黃連不同部位的蛋白質(zhì)豐度及每克樣品中蛋白質(zhì)含量均為：種植黃連根莖>種植黃連莖葉>種植黃連須根，表明種植黃連植株的蛋白質(zhì)差異明顯，根莖部位高于須根和莖葉部位。野生黃連不同部位的蛋白質(zhì)豐度及每克樣品中蛋白質(zhì)含量均為：野生黃連根莖>野生黃連莖葉，表明野生黃連植株的蛋白質(zhì)差異明顯，根莖部位遠高于莖葉部位。通過黃連植株的蛋白質(zhì)豐度及含量分析可對黃連植株的不同部位進行鑒別，對黃連及其產(chǎn)品的市場質(zhì)量進行控制。

本試驗對野生和種植黃連不同部位蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果進行聚類分析，將樣品按照品質(zhì)特性相似程度逐漸聚合在一起，最終按照類別的綜合性質(zhì)使其分類聚合，可知野生與種植黃連根莖蛋白關(guān)聯(lián)關(guān)系較為顯著，與其他部位蛋白關(guān)聯(lián)不顯著。

本試驗優(yōu)選了黃連蛋白質(zhì)的提取方法，建立了野生與種植黃連不同部位蛋白質(zhì)的分子鑒別方法，比較了黃連不同部位蛋白差異，為其初級、次級代謝成分及代謝途徑研究奠定基礎(chǔ)，也可為黃連藥材種質(zhì)資源研究及分子質(zhì)量控制評價提供依據(jù)。

參考文獻：

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