益氣活血消癥方對(duì)良性前列腺增生大鼠細(xì)胞凋亡的影響

袁軼峰 傅顯文 朱文雄

摘要：目的 觀察益氣活血消癥方對(duì)良性前列腺增生大鼠細(xì)胞凋亡的影響，初步探討其作用機(jī)制。方法 將60只8周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、陽(yáng)性對(duì)照組和消癥方低、中、高劑量組，每組10只。除正常組外，其余各組大鼠均予去勢(shì)加丙酸睪酮注射法復(fù)制前列腺增生模型。正常組和模型組大鼠予生理鹽水灌胃，消癥方低、中、高劑量組大鼠分別予益氣活血消癥方10、20、40 mg/100 g灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠予癃開顆粒混懸液11 mg/100 g灌胃，1次/d，連續(xù)30 d。末次給藥24 h后，脫頸處死大鼠，取前列腺組織，免疫組化檢測(cè)大鼠前列腺組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠前列腺組織Bax表達(dá)顯著降低，Bcl-2表達(dá)顯著升高；與模型組比較，各給藥組大鼠前列腺組織Bax表達(dá)顯著升高，Bcl-2表達(dá)顯著降低，且消癥方高劑量組效果最優(yōu)。結(jié)論 益氣活血消癥方可促進(jìn)大鼠前列腺組織細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與前列腺組織Bax蛋白表達(dá)升高、Bcl-2蛋白表達(dá)降低相關(guān)，從而改善良性前列腺增生。

關(guān)鍵詞：益氣活血消癥方；良性前列腺增生；細(xì)胞凋亡；Bax；Bcl-2；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.013

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）09-0052-04

Abstract： Objective To investigate the effects of Yiqi Huoxue Xiaozheng Formula on cell apoptosis in rats with benign prostatic hyperplasia （BPH）； To preliminarily explore its mechanism of action. Methods Totally sixty 8-week-old male SD rats were randomly devided into normal group， positive control group， Yiqi Huoxue Xiaozheng Formula low-， medium-， and high-dose groups， with 10 rats in each group. Except for the rats in normal group， rats in other groups were treated with castrate and testosterone propionate injection to replicate BPH model. The normal group and the model group were given normal saline for gavage； Yiqi Huoxue Xiaozheng Formula low-， middle-， and high-dose groups were given Yiqi Huoxue Xiaozheng Formula 10， 20， 40 mg/100 g for gavage， respectively； rats in positive control group were given Longkai Granule suspension 11 mg/100 g for gavage， once a day， for 30 d. Twenty-four hours after the last administration， the rats were sacrificed by cervical dislocation. The prostate tissue was taken. The protein expressions of Bcl-2 and Bax in the prostate tissue were detected by immunohistochemistry. Results Compared with the normol group， the expression of Bax in the prostate tissue of the model group decreased significantly， while the expression of Bcl-2 increased significantly； Compared with the model group， the expression of Bax in the prostate tissue of rats in administration groups increased significantly， while the expression of Bcl-2 was significantly reduced， and Yiqi Huoxue Xiaozheng Formula high-dose group was superior to other groups. Conclusion Yiqi Huoxue Xiaozheng Formula can improve benign prostatic hyperplasia by promoting the apoptosis of rat prostate tissue， and its mechanism is related to the increase of the expression of Bax protein and the decrease of Bcl-2 protein expression in prostate tissue.

Keywords： Yiqi Huoxue Xiaozheng Formula； benign prostatic hyperplasia； apoptosis； Bax； Bcl-2； rats

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）是男科的常見(jiàn)病，以尿頻、夜尿次數(shù)增多、排尿困難為主要臨床表現(xiàn)，控制不佳者，可并發(fā)尿潴留或尿失禁，甚至腎功能受損等疾患[1]。目前對(duì)于BPH的發(fā)病機(jī)制尚未定論，其治療方式以觀察等待、藥物保守治療及外科手術(shù)為主[2]。臨床常用治療藥物包括5α-還原酶抑制劑、激素、α受體阻滯劑等，因這些藥物的不良反應(yīng)及耐藥性，使其臨床應(yīng)用受到限制；而手術(shù)治療雖可切除增生的前列腺組織，但也存在風(fēng)險(xiǎn)大、遠(yuǎn)期療效不佳等問(wèn)題[3]。大量臨床研究表明，中醫(yī)藥治療BPH有一定的優(yōu)勢(shì)，可明顯改善癥狀[4-7]。益氣活血消癥方為賀菊喬教授臨床治療BPH的經(jīng)驗(yàn)方，本實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)BPH大鼠細(xì)胞凋亡的影響，從分子水平初步探討其抗BPH的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

8周齡雄性SD大鼠60只，SPF級(jí)，體質(zhì)量250～300 g，湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)湘醫(yī)動(dòng)字第20-002號(hào)。飼養(yǎng)于溫度15～18 ℃、濕度70%環(huán)境，自由攝食飲水。

1.2 藥物

益氣活血消癥方（黃芪30 g、白術(shù)15 g、炮山甲6 g、三棱6 g、蒲黃10 g、五靈脂10 g、枳實(shí)15 g、鱉甲10 g等），所有飲片由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供，配制成10 mg/mL湯劑。癃開顆粒，上海雷允上藥業(yè)有限公司，7 g/袋，批號(hào)20170613，臨用時(shí)以生理鹽水配成混懸液。

1.3 主要試劑與儀器

多聚甲醛，天津市化學(xué)試劑研究所；丙酸睪酮注射液，上海第九制藥廠；多聚丙酮，仙桃市第一化工廠；無(wú)水乙醇、磷酸鹽緩沖液（PBS）、醫(yī)用過(guò)氧化氫、二甲苯，長(zhǎng)沙的波化學(xué)試劑廠；中性樹膠，上海標(biāo)本模型廠；Bcl-2、Bax檢測(cè)試劑盒，武漢博士德公司。MIAS圖形圖像分析系統(tǒng)（Professional Series，廈門），透射電鏡（日本JEOL公司），石蠟切片機(jī)（英國(guó)山姆公司），雙目顯微鏡（德國(guó)萊卡），微波爐（上海三菱電機(jī)微波爐電器有限公司），電子天平及電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精密科學(xué)儀器有限公司），AB204-S分析天平（臺(tái)灣華科電子儀器有限公司），MP530照相機(jī)（德國(guó)萊卡），超低溫冰箱（日本三洋公司），電熱恒溫水箱（上海市南陽(yáng)儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及造模

實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和消癥方低、中、高劑量組。除正常組外，其余大鼠均予去勢(shì)加丙酸睪酮注射法復(fù)制BPH模型。先去毛，皮膚局部消毒，麻醉（水合氯醛3.5 mg/kg）、摘除雙側(cè)睪丸。正常組僅麻醉后切開腹腔，游離但不摘除雙側(cè)睪丸，結(jié)扎止血后常規(guī)縫合。術(shù)后每只大鼠肌注青霉素20萬(wàn)U，待大鼠清醒后觀察其生命體征。各組造模大鼠從摘除睪丸后第8日開始背部皮下注射丙酸睪酮5 mg/kg[8-10]。

2.2 給藥

根據(jù)體表面積折算，癃開顆粒、益氣活血消癥方大鼠臨床給藥劑量分別為11 mg/100 g、10 mg/100 g。注射丙酸睪酮同時(shí)，消癥方低、中、高劑量組予低、中、高濃度益氣活血消癥方灌胃，分別為臨床給藥劑量的1、2、4倍，陽(yáng)性對(duì)照組予癃開顆?；鞈乙撼Ｒ?guī)劑量灌胃，正常組和模型組予等量生理鹽水灌胃。給藥體積1 mL/100 g，每日1次，連續(xù)30 d。每周稱重1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整用藥劑量。末次給藥24 h后，脫頸處死大鼠，取前列腺組織。

2.3 Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)檢測(cè)

將前列腺組織置于多聚甲醛溶液，脫水，石蠟包埋、切片，按照試劑盒說(shuō)明操作，滴加一抗后PBS清洗，再滴加二抗。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，光學(xué)樹脂膠封固，MIAS圖形圖像系統(tǒng)分析。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野（×400），計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞總面積、積分光密度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，方差齊用LSD法，方差不齊用KW-H檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

Bcl-2、Bax蛋白在正常前列腺組織中無(wú)陽(yáng)性表達(dá)或較少表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)位于腺上皮細(xì)胞胞漿，呈棕黃色。正常組大鼠前列腺組織基本無(wú)陽(yáng)性顆粒，Bcl-2、Bax不表達(dá)；模型組大鼠前列腺組織Bcl-2陽(yáng)性顆粒增加，Bax陽(yáng)性顆粒減少；消癥方各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠Bcl-2陽(yáng)性顆粒灰度逐漸變暗，Bax陽(yáng)性顆?；叶戎饾u變亮，均以消癥方高劑量組效果最明顯。見(jiàn)圖1、圖2。與正常組比較，模型組大鼠前列腺組織Bcl-2表達(dá)顯著升高，Bax表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠前列腺組織Bcl-2表達(dá)顯著降低，Bax表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），且消癥方高劑量組效果最優(yōu)。見(jiàn)表1、表2。

5 討論

BPH常見(jiàn)于中老年人，受多種因素影響。老年時(shí)期，某些因素的影響使機(jī)體調(diào)控機(jī)制失衡。平衡機(jī)制包括兩個(gè)方面：一是由細(xì)胞周期調(diào)控的細(xì)胞增殖，二是由凋亡調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡減少或細(xì)胞增殖，均可導(dǎo)致前列腺細(xì)胞堆積而形成前列腺增生。目前，將細(xì)胞凋亡相關(guān)基因根據(jù)功能大致分為3大類：凋亡抑制基因（Bcl-2、IAP、EIB）、凋亡促進(jìn)基因（Bax、Fas、ICE、p53）及雙向凋亡基因（c-myc、Bcl-x）。其中Bcl-2與Bax被認(rèn)為是參與前列腺組織細(xì)胞凋亡過(guò)程最重要的調(diào)節(jié)基因。Bcl-2為凋亡抑制基因，可通過(guò)增加雙氫睪酮或調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子，使前列腺組織上皮細(xì)胞增生，腺腔變大，分泌物增多。Bax為凋亡促進(jìn)基因，可抑制上皮細(xì)胞的增殖，而在BPH形成時(shí)，該基因的抑制作用則表達(dá)不明顯或不表達(dá)。通過(guò)調(diào)整兩者的比例可發(fā)揮抑制前列腺上皮增生的作用，從而改善前列腺組織的增生。

中醫(yī)學(xué)無(wú)BPH的病名，一般將其歸屬于“癃閉”范疇。賀教授根據(jù)40余年的臨證經(jīng)驗(yàn)提出，BPH應(yīng)屬“癥瘕”，發(fā)病基礎(chǔ)為排尿無(wú)力、尿不盡、射程較短。BPH發(fā)病人群多為老年人，年老體弱、陽(yáng)氣不足，氣虛則無(wú)力推動(dòng)血液運(yùn)行，久則成瘀；瘀血進(jìn)一步阻滯氣機(jī)，形成惡性循環(huán)。臨床上，肛門指檢?？捎|及增大的前列腺組織并有壓痛，B超可見(jiàn)腺體增生，望診常見(jiàn)舌質(zhì)紫黯或有瘀斑、瘀點(diǎn)，脈象診之為澀脈等，皆可證實(shí)氣虛血瘀是BPH的重要病理基礎(chǔ)。清·王清任指出：“癥瘕積聚，壓迫膀胱水道，則發(fā)為閉癃。”強(qiáng)調(diào)癥瘕的形成皆與瘀血有關(guān)?！鹅`樞·天年》云：“六十歲，心氣始衰……血?dú)庑付?，故好臥?！逼咔閮?nèi)傷，肝失疏泄，氣郁阻滯，血行不暢致血瘀；或因過(guò)度忍精不泄，敗精阻于內(nèi)，血脈不通；或因腎元虧虛，溫煦推動(dòng)氣血運(yùn)行失職而致瘀。膀胱精室為瘀血所阻，膀胱氣化不利，水道不通，最終導(dǎo)致氣滯、血瘀、水停，三者共同促使癥瘕形成?？梢?jiàn)，癥瘕之形成歸根于氣血運(yùn)行失調(diào)。氣虛、氣滯皆致血運(yùn)受阻，瘀血內(nèi)阻日久而成癥瘕。因此，調(diào)氣和血、化瘀消癥為治療癥瘕的基本方法。癥積得散，水道自通，則癃閉亦愈。

益氣活血消癥方具有益氣活血、消癥止痛的功效。方中黃芪益氣利水，氣化則水行，小便得通。徐薇等[11]研究表明，黃芪對(duì)前列腺增生大鼠有減輕前列腺濕重及逆轉(zhuǎn)前列腺增生的作用。古代醫(yī)家認(rèn)為，“正氣內(nèi)存、邪不外干”“邪之所湊，其氣必虛”。穿山甲、蒲黃、三棱配伍具有活血化瘀兼利尿通淋之功，黃芪、白術(shù)與三藥配伍標(biāo)本兼顧，活血通淋不傷正，扶正不斂邪。五靈脂有活血止痛之效。氣血瘀滯，氣機(jī)運(yùn)行不暢，加重局部疼痛，因此，方中加用枳實(shí)以行氣消癥止痛?！皻鉃檠畮?，血為氣之母”，補(bǔ)氣時(shí)若不輔以滋陰養(yǎng)血，補(bǔ)氣必定達(dá)不到效果，且大量使用通淋藥物，必傷陰液，故加用鱉甲以養(yǎng)陰。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠前列腺組織Bax表達(dá)顯著降低，Bcl-2表達(dá)顯著升高；與模型組比較，各給藥組大鼠前列腺組織Bax表達(dá)顯著升高，Bcl-2表達(dá)顯著降低，消癥方高劑量組效果最優(yōu)。

綜上，益氣活血消癥方通過(guò)降低前列腺組織Bcl-2的表達(dá)及升高Bax的表達(dá)，促進(jìn)前列腺組織細(xì)胞凋亡，抑制上皮細(xì)胞增殖，從而達(dá)到治療前列腺增生的效果，為臨床運(yùn)用益氣活血消癥方治療BPH提供依據(jù)。

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（收稿日期：2018-04-09）

（修回日期：2018-05-14；編輯：華強(qiáng)）