左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元病理形態(tài)及凋亡的影響

柳卓 孟盼 楊蕙

摘要：目的 觀察左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥（diabetes mellitus with depression，DD）大鼠海馬神經(jīng)元病理形態(tài)的影響，探討其保護作用機制。方法 采用尾靜脈注射鏈脲佐菌素聯(lián)合慢性應激建立DD大鼠模型。72只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、陽性藥組和左歸降糖解郁方低、中、高劑量組，每組12只，分別給予相應藥物。末次給藥后，檢測大鼠血糖及行為學變化，分別采用HE染色、尼氏染色、高爾基染色觀察大鼠海馬組織病理形態(tài)，免疫組化檢測大鼠海馬Caspase-3的表達。結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠血糖顯著升高，海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，神經(jīng)元凋亡增加，神經(jīng)元胞體出現(xiàn)變形、樹突棘減少等病理損傷情況；給予左歸降糖解郁方干預后，模型大鼠高血糖和抑郁樣狀態(tài)緩解，海馬神經(jīng)元數(shù)量顯著增加，神經(jīng)元形態(tài)基本恢復正常，左歸降糖解郁方高、中劑量組Caspase-3表達較模型組明顯降低。結(jié)論 左歸降糖解郁方可明顯改善DD大鼠血糖和學習記憶能力，其機制可能與減緩海馬損傷和凋亡、恢復神經(jīng)元數(shù)量與形態(tài)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：左歸降糖解郁方；糖尿病并發(fā)抑郁癥；海馬神經(jīng)元；病理形態(tài)；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.011

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）09-0044-05

Abstract： Objective To observe the effects of Zuogui Jiangtang Jieyu Prescription （ZGJTJYP） on pathological morphology of hippocampal neurons in rats of diabetes mellitus with depression （DD）； To discuss its protective mechanism of action. Methods DD rat model was established by tail vein injection of STZ combined with chronic stress. Totally seventy-two SPF rats were randomly divided into normal group， model group， positive medicine group， ZGJTJYP low-， medium-， and high-dose groups， with 12 cases in each group， and were given corresponding medicine. After the last administration， blood glucose and behavioral changes were measured in each group. HE staining， Nissl staining， and Golgi staining were used to observe the changes of pathological morphology in rat hippocampus. The expression of Caspase-3 in hippocampus was detected by immunohistochemistry. Results Compared with the normal group， blood glucose level was significantly increased in the model group； the number of neurons in the hippocampus decreased in the model group； the apoptosis increased in the model group； the neuronal soma showed deformation and reduced dendritic spines and other pathological damages in the model group. After intervention of ZGJTJYP， hyperglycemia and depression-like status of the model rats were relieved； the number of hippocampal neurons increased significantly； neuronal morphology basically returned to normal. The expressionof Caspase-3 in ZGJTJYP high- and medium-dose groups was significantly lower than that in model group. Conclusion ZGJTJYP can significantly improved blood glucose and learning and memory abilities in DD rats， which may be related to slowing hippocampal injury and apoptosis， and restoring neuronal quantity and morphology.

Keywords： Zuogui Jiangtang Jieyu Prescription； diabetes mellitus with depression； hippocampal neuron； pathological morphology； rats

糖尿病并發(fā)抑郁癥（diabetes mellitus with depression，DD）是糖尿病患者最易并發(fā)的疾病之一，我國約51%糖尿病患者存在不同程度的抑郁癥狀。研究表明，DD患者自殺的危險性高達10%，遠高于普通人群的0.01%～0.03%[1]。然而，DD確切的發(fā)病機制至今尚未完全闡明。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，海馬是DD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵靶器官，DD大鼠存在海馬萎縮、凋亡等情況[2]。左歸降糖解郁方有滋陰益氣、化瘀解郁的功效。課題組前期研究顯示，左歸降糖解郁方能緩解海馬星型膠質(zhì)細胞增生紊亂，從而改善大鼠學習記憶功能[3]。糖尿病患者腦內(nèi)海馬谷氨酸含量升高，谷氨酸堆積并釋放到細胞外可引起海馬的神經(jīng)興奮性毒性，進而造成海馬損傷并導致抑郁發(fā)生。本課題組前期采用皮質(zhì)酮和高濃度糖皮質(zhì)激素成功建立了DD動物模型[4]，本實驗在此基礎上，采用HE染色、尼氏染色、高爾基染色和免疫組化方法觀察左歸降糖方對DD大鼠海馬神經(jīng)元病理形態(tài)的影響，探討其保護作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級SD雄性大鼠72只，體質(zhì)量190～230 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2013-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院SPF級動物房，溫度（25±1）℃，相對濕度40%～60%，自由攝食飲水，實驗前適應性飼養(yǎng)3 d。

1.2 藥物

左歸降糖解郁方（姜黃9 g，牛膝9 g，丹參12 g，枸杞子12 g，山萸肉12 g，貫葉連翹3 g，黃芪18 g，牡丹皮6 g，熟地黃15 g，菟絲子9 g，杜仲9 g），飲片購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房，由制劑室監(jiān)制；鹽酸二甲雙胍片，湖南湘雅制藥公司，批號150123；鹽酸氟西汀膠囊，加拿大Patheon公司，批號SS41A。

1.3 主要試劑與儀器

One Touch Ⅱ血糖儀及血糖試紙（美國強生公司），尼氏染色液（上海博谷生物科技有限公司），高爾基染色試劑盒（美國Genmed公司），Caspase-3抗體（美國Abcam公司），二抗試劑盒（中杉金橋），DAB試劑盒（中杉金橋），蘇木素（中杉金橋），封閉液（中杉金橋）。Morris水迷宮（北京智鼠多寶生物科技有限責任公司），DVP-W7顯微鏡圖像處理系統(tǒng)（日本Olympus公司），Olympus生物顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模和給藥

高脂飼料灌胃聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素（38 mg/kg）尾靜脈注射，連續(xù)14 d，選取空腹血糖≥16.00 mmol/L大鼠作為糖尿病模型大鼠。隨機分為模型組、陽性藥組和左歸降糖解郁方高、中、低劑量組（中藥高、中、低劑量組）。繼續(xù)給予慢性不可預見性應激，應激方法包括4 ℃冰水浴、45 ℃熱水浴、晝夜顛倒、傾籠等，每日采用1種刺激并不連續(xù)出現(xiàn)，期間大鼠均孤籠飼養(yǎng)[5]。中藥高、中、低劑量組分別予左歸降糖解郁方20.53、10.26、5.13 g/kg水煎液，陽性藥組大鼠給予鹽酸二甲雙胍0.18 g/kg+氟西汀1.8 mg/kg，空白組和模型組給予生理鹽水。給藥體積均為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)28 d。

2.2 血糖測定

動物禁食不禁水8 h，剪去大鼠尾尖取血，使用血糖儀測定血糖并記錄。

2.3 Morris水迷宮實驗

實驗共進行5 d。第1～4日在水面下放置一個平臺，按逆時針方向?qū)⒋笫竺嫦虺乇诜湃胨?，觀察并計時90 s。大鼠尋找并爬上平臺的時間為逃避潛伏期，如大鼠未找到平臺則記為90 s。第5日撤去平臺，觀察并記錄大鼠進入目標象限的時間。

2.4 海馬組織病理形態(tài)觀察

每組取6只大鼠，末次給藥后12 h，禁食24 h，10%水合氯醛4 mL/kg腹腔麻醉，用輸液器快速灌注200 mL生理鹽水，再用4%多聚甲醛灌注，直至無血液流出，尾部及四肢均僵硬，斷頭取腦。將標本固定于10%固定液中。

2.4.1 HE染色

標本置于固定液中固定24 h，0.01 mol/L PBS浸泡12 h，脫水，石蠟包埋，切片，染色后脫水并用中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察、拍照。

2.4.2 尼氏染色

氯仿中冰凍切片1 min，空氣中放置1～2 d自然晾干，梯度乙醇脫水，37 ℃溫箱中尼氏染色10 min，蒸餾水洗滌，95%乙醇分色，脫水，透明，封片。

2.4.3 高爾基染色

大鼠麻醉后，雙蒸水去血漬后將腦組織浸泡于媒染液（濃甲醛、蒸餾水、水合氯醛、重鉻酸鉀），避光放置3 d。1%硝酸銀浸泡鍍銀，連續(xù)3 d換銀液并置暗處3 d。切片，漂洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2.4.4 免疫組化檢測

常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，切片（厚度5 μm）。脫蠟后加3%H2O2室溫反應20 min，PBS清洗。血清工作液封閉15 min后加Caspase-3抗體（1∶50），4 ℃過夜。隔日取出30 min恢復室溫后，PBS 沖洗5 min×3次。滴加二抗試劑盒，反應20 min。沖洗，DAB染色，蘇木素復染后用中性樹膠封片。高倍鏡下拍攝，采用Image Pro軟件分析積分光密度（IOD）。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，當數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性且組間方差齊時采用方差分析；如不滿足則用非參數(shù)檢驗法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 Morris水迷宮實驗結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，陽性藥組和中藥高劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)果見表1。

4.2 左歸降糖解郁方對模型大鼠空腹血糖的影響

與空白組比較，模型組大鼠血糖顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，陽性藥組和中藥高、中劑量組大鼠血糖明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表2。

4.3 HE染色結(jié)果

正常組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則，排列整齊，染色質(zhì)均勻，神經(jīng)元間隙正常；模型組大鼠海馬神經(jīng)元胞體腫脹，核固縮，胞漿濃縮深染，呈一定的空泡狀，神經(jīng)元之間排列紊亂無序，間隙拉長；陽性藥和中藥高劑量組大鼠海馬空泡細胞數(shù)明顯減少，神經(jīng)元損傷程度明顯減輕并且排列趨于整齊。見圖1。

4.4 尼氏染色結(jié)果

正常組大鼠海馬尼氏染色可見神經(jīng)元呈塊狀或顆粒狀，排列整齊、緊湊；模型組大鼠海馬神經(jīng)元排列散亂，分布較稀疏，細胞帶出現(xiàn)斷裂，存活細胞數(shù)顯著減少，大量神經(jīng)元出現(xiàn)尼氏體碎裂，胞質(zhì)淡染，核變小。與正常組比較，模型組大鼠海馬存活神經(jīng)元數(shù)量顯著減少（P<0.05）；陽性藥組和中藥高劑量組大鼠海馬神經(jīng)元排列尚整齊，但細胞間隙增寬，少量神經(jīng)元可見尼氏體碎裂，胞質(zhì)中央尼氏小體消失；與模型組比較，陽性藥組和中藥高、中劑量組大鼠海馬存活神經(jīng)元數(shù)量顯著增加（P<0.05，P<0.01）。見圖2、表3。

4.5 高爾基染色結(jié)果

正常組大鼠海馬神經(jīng)元胞核清晰且形態(tài)規(guī)則，第二、三級樹突棘排列密集整齊；模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元胞體變形，部分神經(jīng)元消失，形成不規(guī)則狀空泡，胞間間隔增大，未見明顯的銀染樹突棘；陽性藥組和中藥高劑量組可在一定程度上逆轉(zhuǎn)大鼠海馬錐體細胞胞體的形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷、恢復樹突復雜性和可塑性，而中藥中、低劑量組僅能略恢復神經(jīng)元的數(shù)目和排列整齊度。見圖3。

4.6 左歸降糖解郁方對模型大鼠海馬Caspase-3蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠海馬區(qū)Caspase-3蛋白表達IOD值明顯增加（P<0.01）；與模型組比較，陽性藥組和中藥高、中劑量組大鼠海馬Caspase-3蛋白表達明顯降低（P<0.05，P<0.01）。見圖4、表2。

5 討論

臨床研究表明，糖尿病患者存在不同程度的認知功能障礙，而海馬與認知功能密切相關(guān)，是學習、記憶的重要解剖部位和神經(jīng)中樞，海馬結(jié)構(gòu)和功能損傷是抑郁癥患者最常見的病理變化[6]。課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，DD模型大鼠出現(xiàn)認知功能下降[7]。左歸降糖解郁方由張景岳左歸飲加減而來，方中以熟地黃為君藥，山萸肉、枸杞子為臣藥，共奏滋養(yǎng)腎陰之功效，佐以菟絲子、牛膝和杜仲補肝腎，黃芪益氣健脾，丹參、牡丹皮活血化瘀，加入姜黃、貫葉連翹以化瘀行氣、疏肝解郁，全方有滋陰益氣、化瘀解郁的功效。前期實驗表明，左歸降糖解郁方能明顯改善DD大鼠血糖血脂代謝紊亂和抑郁樣行為，并可延緩海馬損傷的發(fā)展[8-10]。

HE染色結(jié)果顯示，陽性藥及高劑量左歸降糖解郁方可改善模型大鼠海馬神經(jīng)元核固縮等狀況。尼式小體是結(jié)構(gòu)蛋白和分泌蛋白的合成中心，當神經(jīng)元受到損害，尼式小體逐漸分解以至消散。尼氏染色結(jié)果顯示，相比DD狀態(tài)下大鼠海馬神經(jīng)元存活細胞數(shù)的減少，各給藥組海馬存活神經(jīng)元數(shù)量顯著增加。提示左歸降糖解郁方有減輕DD大鼠腦組織神經(jīng)元病理形態(tài)學改變、修復神經(jīng)元損傷的作用。高爾基染色是一種準確、可靠的神經(jīng)組織染色。高爾基染色結(jié)果顯示，陽性藥及高劑量左歸降糖解郁方在一定程度上逆轉(zhuǎn)DD模型大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元呈現(xiàn)不規(guī)則空泡及部分神經(jīng)元消失。說明左歸降糖解郁方有修復突觸形態(tài)的作用。

Caspases是哺乳動物細胞凋亡的啟動者和執(zhí)行者，Caspase-3是Caspases級聯(lián)“瀑布”下游最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶，Caspase-3是對細胞凋亡具有關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)。本實驗結(jié)果顯示，模型組Caspase-3蛋白表達明顯升高，表明DD大鼠海馬神經(jīng)元存在凋亡，中藥高、中劑量組Caspase-3蛋白表達較模型組明顯減少，可見左歸降糖解郁方可明顯緩解凋亡情況。

綜上所述，左歸降糖解郁方可改善DD大鼠血糖和學習記憶能力，其作用可能與減緩海馬損傷、恢復神經(jīng)元數(shù)量與形態(tài)有關(guān)，其調(diào)控細胞損傷的機制有待進一步研究。

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（收稿日期：2018-03-13）

（修回日期：2018-04-03；編輯：華強）

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