補腎活血針刺法對SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響

薩依臘西·杰恩斯努爾 肖嵐 龍見汝

摘要：目的 觀察補腎活血針刺法對阿爾茨海默病（AD）模型SAMP8小鼠行為學(xué)及海馬內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響。方法 將18只7月齡雄性SAMP8小鼠作為AD模型，隨機分為針刺組、非穴組和模型組，另取同月齡雄性SAMR1小鼠6只作為正常組。針刺組小鼠選取“腎俞”“百會”“血?！薄半跤帷边M行針刺干預(yù)，非穴組小鼠取雙側(cè)肋下固定非穴點進行針刺，模型組和正常組小鼠予相同程度捉抓刺激，連續(xù)干預(yù)8周。采用水迷宮實驗檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，免疫組化檢測海馬BrdU陽性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果 與正常組比較，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長（P<0.05），停留在原平臺象限時間明顯縮短（P<0.05），BrdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少（P<0.05）；與模型組、非穴組比較，針刺組小鼠逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05），停留在原平臺象限時間明顯延長（P<0.05），BrdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加（P<0.05）。結(jié)論 補腎活血針刺法可能通過誘導(dǎo)海馬內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，改善AD模型SAMP8小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

關(guān)鍵詞：補腎活血；針刺；阿爾茨海默病；神經(jīng)干細(xì)胞增殖；SAMP8小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.009

中圖分類號：R245 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）09-0035-04

Abstract： Objective To investigate the effects of Bushen Huoxue acupuncture method on the behavioral changes and the proliferation of endogenous neural stem cells （NSCs） in hippocampus of Alzheimer disease （AD） model mice. Methods 18 male SAMP8 mice， seven months old， were randomly divided into acupuncture group， non-acupoint control group， and model control group. And another age-matched 6 male SAMR1 mice were prepared as normal control group. Mice in acupuncture group were intervened by acupuncture method in the acupoints of “Shenshu”， “Baihui”， “Xuehai”， and “Geshu”. Mice in non-acupoint control group were treated by stimulating the fixed non-point under the bilateral rib， while mice in model control group and normal control group were raised without special treatment but administered the stimulation of catching with the same time and the same stimulus intensity. All treatrment lasted for 8 weeks. After the intervention， the learning and memory abilitities and brain hippocampus BrdU positive cells of all groups were detected. Results Compared with the nomal control group， mice in the model control group had longer escape latency and less time spent in former platform quadrant （P<0.05）； the number of BrdU positive cells decreased significantly （P<0.05）. Compared with the model control group and the non-acupoint control group， mice in the acupuncture group had shorter escape latency and more time spent in former platform quadrant （P<0.05）； the number of BrdU positive cells increased significantly （P<0.05）. Conclusion Bushen Huoxue acupuncture method can improve the learning and memory abilities of SAMP8 mice AD model by inducing the proliferation of hippocampal endogenous NSCs.

Keywords： Bushen Huoxue； acupuncture method； Alzheimer disease； NSCs proliferation； SAMP8 mice

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種與年齡相關(guān)的復(fù)雜性神經(jīng)性疾病，以認(rèn)知功能進行性減退為特征[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補腎活血法對AD認(rèn)知障礙和病情發(fā)展有一定的控制作用[2]；補腎活血針刺法通過抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)β淀粉樣蛋白代謝、抑制神經(jīng)反應(yīng)及修復(fù)細(xì)胞骨架等方面的作用改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[3-4]。神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell，NSCs）是一類具有自我產(chǎn)生新細(xì)胞及分化能力的多能干細(xì)胞，其相關(guān)研究已成為神經(jīng)學(xué)科領(lǐng)域熱點。本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，采用Morris水迷宮實驗和免疫組化方法，觀察補腎活血針刺法對AD模型SAMP8小鼠行為學(xué)及海馬內(nèi)源性NSCs增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

清潔級雄性7月齡SAMP8小鼠18只、SAMR1小鼠6只，體質(zhì)量（28±1.5）g，購于天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗中心，動物質(zhì)量合格證號0001353。飼養(yǎng)于中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院實驗動物中心，溫度20～23 ℃，相對濕度55%～58%，每日12 h照明，自由攝食飲水，單籠通氣通風(fēng)。所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，AD模型SAMP8小鼠隨機分為針刺組、非穴組和模型組，每組6只，6只SAMR1小鼠為正常組。

1.2 主要試劑與儀器

BrdU粉末，美國Sigma；Rat-anti-BrdU，美國Serotec；Goat-anti-rat IgG，德國Vector Laboratories；ABC試劑，德國Vector Laboratories。移液槍，美國Eppendoff；0.30 mm×25 mm華佗牌一次性針灸針，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；Morris水迷宮，中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院動物實驗中心；光學(xué)顯微鏡及彩色圖像分析系統(tǒng)，日本Olympus。

1.3 干預(yù)

針刺組用補腎活血針刺法進行干預(yù)，選取“百會”（頂骨正中，即頭頂兩耳根連線的中點）、“血?！保ê笾蓛?nèi)側(cè)中間，髕底內(nèi)側(cè)端至恥骨聯(lián)合連線下1/9處）、“腎俞”（第2腰椎下兩旁）及“膈俞”（第7胸椎下兩旁肋間）?！鞍贂毕蚯捌酱?～4 mm，施捻轉(zhuǎn)平補平瀉法；“腎俞”直刺2～3 mm，施捻轉(zhuǎn)補法；“血海”直刺2～3 mm，施捻轉(zhuǎn)瀉法；“膈俞”以80°角斜向上刺2～3 mm，施捻轉(zhuǎn)瀉法。每個施針穴位間歇5 min，捻轉(zhuǎn)1次。其中“腎俞”“膈俞”“血?！毕柔槾套髠?cè)，隔日再針刺右側(cè)。小鼠穴位定位及針刺深度均參照“動物針灸穴位圖譜”[5]。補瀉手法參照石學(xué)敏院士制定的針刺手法量學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，即針刺后開始捻轉(zhuǎn)時拇指向順時針捻轉(zhuǎn)為補，逆時針則為瀉[6]。非穴組參照韓景獻(xiàn)教授經(jīng)驗采取針刺雙側(cè)脅下固定非穴位點作為對照刺激點，斜刺進針2～3 mm，用平補平瀉捻轉(zhuǎn)手法進行干預(yù)，先針刺左側(cè)，隔日再針刺右側(cè)[7]。模型組和正常組每日參照針刺組以同樣方式和程度、在相同時間進行抓取和固定。各組小鼠每日處理1次，連續(xù)6 d，第7日休息，連續(xù)8周。

1.4 行為學(xué)檢測

干預(yù)結(jié)束后采用Morris水迷宮實驗進行行為學(xué)測試。隱蔽平臺實驗：將平臺放置于第2象限，將小鼠置于平臺15 s，并依次從第1、3、4象限入水點投放小鼠，記錄該鼠找到平臺的時間，即為逃避潛伏期。如小鼠超過60 s尚未找到平臺，則由實驗者將小鼠引至平臺，并讓小鼠在平臺上停留15 s，逃避潛伏期記為60 s?？臻g探索實驗：撤去平臺，由第4象限入水，觀察小鼠60 s內(nèi)無平臺條件下尋找記憶中平臺游泳軌跡，記錄小鼠在原平臺象限的停留時間。

1.5 BrdU標(biāo)記法及取材

處死動物前7 d，小鼠腹腔注射BrdU（50 mg/kg），每日1次，連續(xù)7 d。BrdU溶于含有0.28 g/L氫氧化鈉的生理鹽水，配制BrdU濃度為5 mg/mL。注射BrdU藥物1周后第2日，麻醉腦組織取材，4%多聚甲醛固定，脫水，包埋，腦組織冠狀冰凍切片（厚度30 μm），用于BrdU免疫組化檢測。

1.6 免疫組化檢測

腦切片復(fù)溫30 min，PBS洗3次；3%H2O2封閉10 min；PBS洗3次。甲酰胺65 ℃水浴40 min抗原修復(fù)，PBS洗3次；2 mol/L鹽酸37 ℃水浴40 min解開DNA雙鏈，PBS洗3次；0.01 mmol/L Tris-HCL修復(fù)，PBS洗3次；滴加BrdU一抗（1∶4000），4 ℃冰箱保存。滴加Goat-anti-rat IgG（1∶400）二抗，室溫孵育2 h；PBS洗3次；滴加ABC試劑（1∶400）三抗，室溫孵育2 h；PBS洗3次；DAB顯色，蘇木素染核；脫水，透明，封片。鏡下采集圖像并計數(shù)，隨機選5個視野觀察，計數(shù)海馬及海馬周圍BrdU陽性表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示。采用方差分析，方差齊兩兩比較用LSD或SNK檢驗，方差不齊用秩和檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 補腎活血針刺法對SAMP8小鼠Morris水迷宮實驗學(xué)習(xí)能力的影響

與正常組比較，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長（P<0.05）；與模型組、非穴組比較，針刺組逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05）。結(jié)果見表1。

2.2 補腎活血針刺法對SAMP8小鼠Morris水迷宮實驗記憶能力的影響

與正常組比較，模型組小鼠停留在原平臺象限時間明顯縮短（P<0.05）；與模型組、非穴組比較，針刺組小鼠停留在原平臺象限時間明顯延長（P<0.05）。結(jié)果見表2。

2.3 補腎活血針刺法對SAMP8小鼠海馬內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響

免疫組化染色結(jié)果顯示，海馬BrdU陽性表達(dá)主要分布在齒狀回的顆粒細(xì)胞下層，BrdU陽性表達(dá)為細(xì)胞漿或細(xì)胞核為棕褐色或淡黃色，細(xì)胞呈散在分布，見圖1。與正常組比較，模型組小鼠腦內(nèi)海馬BrdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少（P<0.05）；與模型組、非穴組比較，針刺組小鼠腦內(nèi)海馬BrdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加（P<0.05），見表3。

3 討論

NSCs具有自我更新能力，正常情況下處于靜止?fàn)顟B(tài)，受到刺激或病理情況下，其增殖能力增強，并可分化各種存在于動物胚胎中和成年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的特殊神經(jīng)細(xì)胞。內(nèi)源性NSCs常多見于動物腦內(nèi)的海馬、紋狀體、皮質(zhì)、嗅球及側(cè)腦室下區(qū)等部位。本研究采用BrdU標(biāo)記法，其作為體現(xiàn)細(xì)胞增殖較為理想的指標(biāo)，BrdU陽性細(xì)胞可看作增殖的內(nèi)源性NSCs。BrdU標(biāo)記時給藥劑量太小，陽性細(xì)胞數(shù)量少、著色淡，因而不容易辨別，給藥劑量太大則毒性大反而會減少陽性細(xì)胞數(shù)。有研究認(rèn)為，BrdU給藥劑量為50 mg/kg時，可保證攝取足夠的BrdU數(shù)用于新生細(xì)胞DNA的合成[8]。本實驗標(biāo)記NSCs增殖的BrdU注射液劑量為50 mg/kg，切片經(jīng)熱抗原修復(fù)、DNA變性、解鏈后，目的細(xì)胞顯色好，易于辨認(rèn)計數(shù)，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

多項實驗研究表明，針刺可改善老年癡呆模型動物的記憶和認(rèn)知障礙[9-12]。本研究結(jié)果顯示，隱蔽平臺實驗針刺組較模型組、非穴組逃避潛伏期明顯縮短，空間探索實驗針刺組小鼠停留在原平臺象限時間較模型組、非穴位組明顯延長，表明補腎活血針刺法刺激可改善AD模型SAMP8小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。BrdU免疫組化結(jié)果顯示，針刺組小鼠腦內(nèi)海馬BrdU陽性細(xì)胞數(shù)較模型組、非穴組明顯增加，表明補腎活血針刺法刺激可誘導(dǎo)AD模型SAMP8小鼠腦內(nèi)內(nèi)源性NSCs的增殖。

補腎活血為針刺法的選穴依據(jù)，百會是手少陽、足太陽、足少陽、足厥陰之交會穴，位于腦部巔頂處，是所有陽脈的交匯之處，內(nèi)應(yīng)于腦，是調(diào)節(jié)腦功能的要穴。有研究發(fā)現(xiàn)，電針“百會”可改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知損傷[13]，提高APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的記憶能力[14]。腎俞位于足太陽膀胱經(jīng)經(jīng)脈上，有益腎固精、疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)節(jié)大腦的作用。膈俞為八會穴之血會，有活血功效，臨床上常與血海配伍治療多種血瘀病證?，F(xiàn)代研究表明，電針“百會”“腎俞”“膈俞”對擬血管性癡呆小鼠的腦缺血缺氧及腦水腫狀態(tài)有明顯的改善作用[15]。血海為血證要穴，能補血活血。有研究發(fā)現(xiàn)，針刺“血?！笨刹煌潭鹊赜绊懘笫笱焊吣蹱顟B(tài)、血流狀態(tài)及毛細(xì)血管狀態(tài)，進而改善機體的微循環(huán)、新陳代謝及臟器功能的平衡等[16]。我們前期采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究發(fā)現(xiàn)，以補腎活血為針刺法干預(yù)SAMP8小鼠可調(diào)節(jié)其杏仁核內(nèi)相關(guān)氧化應(yīng)激、線粒體能量等多種蛋白質(zhì)的表達(dá)[17]。結(jié)合本實驗結(jié)果，我們推測補腎活血針刺法可通過誘導(dǎo)腦內(nèi)源性NSCs增殖而促進神經(jīng)損傷修復(fù)、改善AD模型SAMP8小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能，進而為針灸治療AD的研究提供新的思路和理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] FARR S A， PRICE T O， DOMINGUEZ L J， et al. MiR-195 dependent roles of mitofusin2 in the mitochondrial dysfunction of hippocampal neurons in SAMP8 mice[J]. J Alzheimers Dis，2012，28（1）：81-92.

[2] 朱宏，董克禮，吳岳.補腎活血法對阿爾茨海默病患者認(rèn)知功能改善的影響[J].中國老年雜志，2010，30（11）：1493-1495.

[3] 戴思思，董克禮，朱宏.“補腎活血”針刺法對老年性癡呆模型SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和腦組織AChE活性的影響[J].上海針灸雜志，2010，29（1）：57-59.

[4] 朱宏，董克禮，李廣城，等.“補腎活血”針刺法對SAMP8小鼠海馬蛋白質(zhì)表達(dá)的影響[J].中國老年學(xué)雜志，2011，31（23）：4613-4461.

[5] 李忠仁.實驗針灸學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：327.

[6] 卞金玲，張春紅.石學(xué)敏院士針刺手法量學(xué)的概念及核心[J].中國針灸，2003，23（5）：287-289.

[7] 吳幫啟，劉存志，于建春，等.針刺研究中假針刺組的設(shè)置概況[J].上海針灸雜志，2009，28（1）：59-61.

[8] 王衛(wèi)東，王洪典，王冰，等.反映成年大鼠腦組織神經(jīng)發(fā)生水平顯示方法的靈敏性和可靠性評價[J].中國臨床康復(fù)，2002，6（13）：1502-1507.

[9] 韓向博，王鑫，姜婧，等.電針對SAMP8小鼠海馬區(qū)PS1蛋白表達(dá)的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2015，15（22）：4225-4229，4234.

[10] 張學(xué)婷，張磊，周英奕，等.電針“百會”“涌泉”穴對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬β淀粉樣蛋白及載脂蛋白E水平的影響[J].針灸臨床雜志， 2017，33（12）：73-77.

[11] 張翠翠.針刺對AD模型大鼠海馬凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的影響[J].四川生理科學(xué)雜志，2014，36（2）：62-63.

[12] LI G， ZHANG X， CHENG H， et al. Acupuncture improves cognitive deficits and increases neurondensity of the hippocampus in middle-aged SAMP8 mice[J]. Acupunct Med，2012，30（4）：339-345.

[13] LIN R H， CHEN J X， LI X J， et al. Electroacupuncture at the Baihui acupoint alleviates cognitive impairment and exerts neuroprotective effects by modulating the expression and processing of brain derived neurotrophic factor in APP/PS1 transgenic mice[J]. Molecular Medicine Reports，2016，13：1611-1617.

[14] 卓沛元，柳維林，吳潔，等.電針百會穴對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠18F-FDG PET/CT成像及學(xué)習(xí)記憶的影響[J].中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志， 2016，31（10）：1050-1053.

[15] 趙建新，田元祥，曹剛，等.電針腎俞、膈俞、百會穴對擬血管性癡呆小鼠腦缺血、缺氧、腦水腫的影響[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2000，6（6）：60-64.

[16] 張瑋，蘇利強，趙廣高，等.針刺血海穴對反復(fù)力竭游泳大鼠血清IFN-γ和IL-4影響的研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2011，22（12）：3019-3021.

[17] 梁梅亭，朱宏，董克禮，等.補腎活血針刺法對SAMP8小鼠杏仁核蛋白質(zhì)組學(xué)表達(dá)的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2018，25（3）：58-63.

（收稿日期：2018-01-25）

（修回日期：2018-03-20；編輯：華強）