HPLC法同時測定山楂中展青霉素和5-羥甲基糠醛的含量

吳 仲 ，張 勛

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122；2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，茶學(xué)福建省高等學(xué)校重點實驗室，福建福州350002）

薔薇科植物山楂適應(yīng)性強[1]，在我國各地均有分布，常用作園林綠化植物[2]，其干燥果實作為一種藥食同源的藥材，含有豐富的生物活性物質(zhì)[3-4]，具有健脾開胃、消食化滯等作用，在臨床上有廣泛的應(yīng)用[5-6]。在休閑食品[7-8]、動物飼料[9-11]等領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越受到關(guān)注，推廣山楂可謂兼具生態(tài)效應(yīng)和經(jīng)濟效益[12]。展青霉素（Patulin）又稱棒曲霉素，是曲霉屬、青霉屬、絲衣霉屬等菌種的次級代謝產(chǎn)物，是一種神經(jīng)毒素，具有潛在的致癌、致畸、致突變性，且可以穩(wěn)定存在[13-15]。其在水果制品中廣泛存在，山楂和山楂片中均有發(fā)現(xiàn)展青霉素的報道[16-17]。目前，GB 2761—2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》對山楂中展青霉素最高允許量做出了明確規(guī)定，而歐盟標準更加嚴格[17]。5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，HMF）主要由美拉德反應(yīng)和己糖酸性條件下脫水產(chǎn)生[18]。HMF本身僅具弱毒性，但其能在體內(nèi)形成具有強致癌和基因毒性的羥甲基糠醛次硫酸鹽等[19-20]。如果山楂產(chǎn)品因加工或貯藏不當?shù)仍虍a(chǎn)生HMF和展青霉素，可能會威脅消費者的身體健康。

因此，建立山楂中展青霉素和HMF的科學(xué)有效的檢測方法，對于山楂制品質(zhì)量安全顯得尤為重要。目前，國內(nèi)檢測展青霉素和HMF采用HPLC法應(yīng)用最為普遍[17，20]。HMF與展青霉素均帶有羥醇、基，結(jié)構(gòu)相似，簡單的提取和凈化過程中二者很難分離[21]。

為有效分離展青霉素和HMF，本研究嘗試采用20%乙腈提取，Myeosep@228AflaPat柱凈化，以建立一種專屬、準確、能同時檢測HMF和展青霉素含量的測定方法，為山楂質(zhì)量控制提供試驗依據(jù)，保障其食用安全。

1 材料和方法

1.1 材料

5份供試山楂樣品從當?shù)夭煌匈徺I，常溫放置72 h，60℃干燥，粉碎。

1.2 試劑

展青霉素/棒曲霉素標準品（批號：O14099，山海安浦實驗科技股份有限公司）；5-羥甲基糠醛（批號：H810986，上海麥克林生化科技有限公司）；甲醇、甲酸、乙腈均為色譜純（默克化工技術(shù)有限公司）；試驗用水皆為實驗室自制二次蒸餾水。

1.3 主要儀器

多功能高速粉碎機（型號：BO-100T，永康市鉑歐五金制品有限公司）；電子天平（型號：AR224CN，奧豪斯儀器（常州）有限公司）；數(shù)控超聲清洗器（型號：KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司）；渦旋儀（型號：VOREX-5，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Myeosep@228AflaPat柱（批號：228088-1512，浙江月旭材料科技有限公司）；Waters e2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）；NEVAP-12氮吹儀（美國Orgranomation公司）；一體化超純水機（型號：MILLI-QDirect16，美國Millipore公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Ultimate@XB-C18（4.6nm×250 nm，5 μm），流動相洗脫條件為等度洗脫乙腈-0.02%甲酸（13∶87）溶液；流速為 1 mL/min；柱溫為30 ℃，進樣量為 10 μL。

1.4.2 標準品溶液的配制 展青霉素—5-羥甲基糠醛混合標準品儲備液：精密稱量并配制100μg/mL展青霉素、125 μg/mL HMF標準品母液，分別量取1 mL展青霉素標準品母液和1.6 mL HMF標準品母液于10 mL容量瓶中，加乙腈適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得展青霉素質(zhì)量濃度為10 μg/mL和HMF質(zhì)量濃度為20 μg/mL的標準品儲備液。

1.4.3 供試品溶液的配制 精密稱取山楂樣品粉末1 g，置25 mL容量瓶中，用20%乙腈溶液定容至刻度，稱質(zhì)量，400 W功率超聲提取5 min，提取溫度為40℃，冷卻后再稱質(zhì)量，用20%乙腈補足至原質(zhì)量，搖勻后靜置片刻，取約10 mL上清液于凈化柱玻璃試管中，將凈化柱插入試管中，至上而下緩慢推進，凈化后的樣品提取液經(jīng)吸附劑進入柱子的上端，精密量取4 mL凈化后的提取液于試管中，微弱氮氣吹至近干，加入20%乙腈水溶液至2 mL后渦旋振蕩30 s，用0.45 μm濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.4.4 檢測波長的選擇 將混合標準品稀釋液在200～450 nm的波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，以確定檢測波長。

1.4.5 流動相的選擇 將流動相甲酸設(shè)0.02%，0.05%等2個濃度，比較其對展青霉素和HMF色譜峰型的影響。

1.4.6 提取溶劑的選擇 將提取溶劑甲醇、乙腈分別設(shè)10%，20%，40%，60%，80%等不同濃度，比較其對超聲提取HMF和展青霉素效果的影響。

1.4.7 凈化柱的選取 采用Myeosep@228AflaPat柱進行凈化，與不使用凈化柱相比較，分析其對測定山楂中展青霉素和HMF含量準確性的影響。

1.4.8 標準曲線繪制 精密吸取混合標準品儲備液1 mL于10 mL量瓶中，20%乙腈定容，依次對半稀釋得9組不同濃度的標準品混合液，編號1～9。進樣量為10 μL，按照1.4.1的液相色譜條件進行測定。以標準品溶液的濃度（C，μg/mL）為橫坐標（X），液相色譜峰的平均峰面積（A，mAU）為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.4.9 精密度試驗 取母液稀釋10倍混合標準品溶液（其中展青霉素、HMF的質(zhì)量濃度分別是10，20 μg/mL）10 μL，進行測定。一天內(nèi)連續(xù)進樣 6 次，記錄峰面積。

1.4.10 穩(wěn)定性試驗 取1份山楂樣品制備供試品溶液，室溫環(huán)境下分別在 0，2，4，6，8，10，12，24，48 h時進樣10 μL，進行測定。

1.4.11 重復(fù)性試驗 取同批山楂樣品6份，1份1 g，按供試品制備方法制備供試品溶液，進行測定。

1.4.12 加樣回收率 取山楂樣品6份，1份1 g，分別加入3個質(zhì)量濃度的標準品混合液（每個濃度3份），依法進行測定，平行測定3次，計算平均回收率及RSD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

混合標準品稀釋液在200～450 nm的波長范圍內(nèi)檢測，HMF的吸收峰峰位在282 nm附近，展青霉素的吸收峰峰位在276 nm附近。檢測波長設(shè)定在280 nm時，二者均可出峰，且峰面積較其他波長大，干擾組分的影響也較小，所以，本研究確定檢測波長為280 nm。

在標準品色譜（圖1）上，各對照品色譜峰理論塔板數(shù)均＞5 000，并且拖尾因子均＜2.0；在供試品色譜（圖2）上，HMF和展青霉素色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均＞2.0，表明本法可用于HMF（峰A）和展青霉素（峰B）的檢測。

2.2 流動相的選擇

由圖3，4可知，0.02%的甲酸可以防止展青霉素和HMF拖尾，峰型較佳，故選擇乙腈-0.02%甲酸做為流動相。

2.3 提取溶劑的選擇

試驗發(fā)現(xiàn)，不同濃度甲醇提取的展青霉素出峰情況不佳；當乙腈濃度在10%～20%時，乙腈濃度與展青霉素、HMF的提取率呈正相關(guān)，而40%的乙腈提取率反而低于20%的乙腈提取率，因此，選擇20%的乙腈作為展青霉素和HMF提取溶劑。

2.4 凈化柱的使用

凈化柱使用前后色譜峰如圖5，6所示，結(jié)果顯示，采取Myeosep@228AflaPat凈化柱后展青霉素和HMF的吸收峰更高。展青霉素和HMF在山楂中為痕量存在，凈化處理能更準確地測定其在山楂中的含量。

2.5 標準曲線繪制

展青霉素和HMF的回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表1所示，結(jié)果表明，二者在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 標準品的線性回歸方程

2.6 精密度試驗

精密度試驗結(jié)果表明，展青霉素、HMF峰面積的RSD分別為0.53%，0.51%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，展青霉素、HMF峰面積的RSD分別為2.23%，5.54%，表明山楂供試品溶液中展青霉素和HMF在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗

重復(fù)性試驗結(jié)果表明，展青霉素、HMF峰面積的RSD分別為1.03%，1.20%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率

加樣回收率試驗結(jié)果列于表2。由表2可知，展青霉素、HMF平均回收率分別為104.01%，100.93%；RSD值分別為1.06%，1.03%，表明該法回收率較理想，適合樣品的處理。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝3）

2.10 樣品檢測

所有山楂樣品測定后，按外標法計算HMF和展青霉素的含量，結(jié)果列于表3。目前，我國僅規(guī)定了蜂蜜中HMF的限量為40 mg/kg，其他食品尚未明確制定限量標準，而歐盟食品安全委員會認為，每人每天攝入HMF的上限為1.6mg[19]。GB2761—2017規(guī)定以蘋果、山楂為原料制成的食品中展青霉素的為限量50 μg/kg。結(jié)果表明，市售山楂可能會因貯藏不當?shù)仍虼嬖贖MF和展青霉素的污染風(fēng)險，以山楂為原料進行休閑食品、保健食品的開發(fā)需強化HMF和展青霉素的質(zhì)量控制。

表3 市售山楂中HMF和展青霉素的含量 μg/g

3 結(jié)論

本研究采用HPLC法測定山楂中展青霉素和HMF，以乙腈-0.02%甲酸做為流動相，在280 nm波長處檢測，結(jié)果表明，該法能有效分離二者，采取Myeosep@228AflaPat凈化柱處理基本能消除脂肪等有機質(zhì)對檢測的干擾，該方法的精密度、穩(wěn)定性和線性關(guān)系均滿足分析檢測的要求。以這種方法檢測山楂中展青霉素和HMF，可滿足對其進行質(zhì)量控制的要求。