獺兔源金黃色葡萄球菌16S rDNA鑒定與耐藥性分析

張國權(quán)，孫樂天，王國艷，王志宇，曹 亮 ，李燕平，任克良

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032；2.太原動物園，山西太原030009）

葡萄球菌是空氣、地面及物體表面等環(huán)境中正常存在的細(xì)菌，同時，也存在于飼料及飲水中，可在不致病的情況下，寄生在人及畜禽的皮膚、黏膜、腸道、呼吸道及乳腺中[1]。金黃色葡萄球菌是葡萄球菌中致病性最強(qiáng)的菌株，常引起全身化膿性炎癥或致死性膿毒敗血癥。兔是對金黃色葡萄球菌最為敏感的一種動物[2-5]。2017年7月中旬，山西省某獺兔場獺兔發(fā)生以呼吸道癥狀為主的疾病，剖解病死兔，從其肺臟、皮膚膿包分離得到疑似優(yōu)勢致病菌株，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室鑒定，確診為金黃色葡萄球菌。

本研究對分離出的山西獺兔源金黃色葡萄球菌進(jìn)行了體外敏感藥物試驗(yàn)，以期對由該病原菌引起的呼吸系統(tǒng)、皮膚化膿等病癥在臨床治療中的藥物選擇上起到一定的指導(dǎo)作用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料來源 其來源于山西省某獺兔養(yǎng)殖場病死獺兔的呼吸系統(tǒng)各器官、皮膚膿包。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 NA固體營養(yǎng)培養(yǎng)基、麥康凱固體瓊脂培養(yǎng)基、肉湯液體培養(yǎng)基、鮮血瓊脂固體培養(yǎng)基。細(xì)菌基因組DNA試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；頭孢氨芐、諾氟沙星、阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、阿莫西林、氧氟沙星、多黏菌素B、卡那霉素、痢特靈、四環(huán)素、頭孢克羅、頭孢曲松、頭孢哌酮等14種抗菌藥物，均購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.1.3 試驗(yàn)動物 從山西省醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心購得16只健康（SPF）體質(zhì)量為30 g的小白鼠，進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原微生物的分離培養(yǎng)

在無菌實(shí)驗(yàn)室中對病料進(jìn)行微生物分離培養(yǎng)，分別劃線接種于NA營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h，觀察其生長狀態(tài)及菌落形態(tài)。

1.2.2 涂片鏡檢 將上述培養(yǎng)物進(jìn)行純化培養(yǎng)后，在無菌實(shí)驗(yàn)室，用鉑金環(huán)挑取純化后的單菌落進(jìn)行革蘭染色、鏡檢。

1.2.3 動物致病性試驗(yàn) 在無菌實(shí)驗(yàn)室，用鉑金環(huán)挑取純化后的單菌落培養(yǎng)物，接種于肉湯液體培養(yǎng)液中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24～36 h后，分別接種8只健康試驗(yàn)小鼠，鼻腔滴入菌懸浮液0.2mL/只。選用8只健康小鼠鼻腔滴入0.2 mL無菌肉湯液體培養(yǎng)液作為陰性對照。

1.2.4 分離菌株16S rDNA基因序列測定 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（購自北京天根生化科技有限公司）提取DNA（1.6 mL培養(yǎng)菌液12 000 r/min離心10 min），將提取到的基因組作為16S rDNA基因PCR擴(kuò)增模板。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫查詢，用Primer 6.0設(shè)計16S rDNA引物，由金唯智基因科技有限公司合成。27F上游引物：5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3′；533R 下游引物：5′-TTACCGCGG CTGCTGGCAC-3′。

反應(yīng)體系：超純水25 uL，DNA模板2.0 μL，5×Pfu Buffer 5.0μL，dNTPs 2.0 μL，Pfu polymerase 0.5 μL，Primer 1和 Primer 2各 1 uL。于 95℃預(yù)變性 2 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，36 個循環(huán)；最后在72℃保溫10 min。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 采用國際通用的K-B紙片法，對獸醫(yī)臨床上常見的14種抗菌藥物進(jìn)行體外敏感藥物篩選試驗(yàn)。選取的試驗(yàn)藥物分別為諾氟沙星、鏈霉素、阿莫西林、氧氟沙星、多黏菌素B、卡那霉素、痢特靈、四環(huán)素、頭孢氨芐、頭孢克羅、頭孢曲松、頭孢哌酮、慶大霉素、阿米卡星。敏感藥物的判定，參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會[4]的標(biāo)準(zhǔn)，按照其抑菌圈直徑的大小進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀及病原微生物的分離培養(yǎng)

由圖1可知，肺部有化膿灶，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長緩慢；在NA營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基上生長出淡灰色、圓形、光滑、隆起、邊緣整齊的菌落；在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長出淡灰色、圓形、光滑、隆起、邊緣整齊且有溶血環(huán)的菌落。

2.2 涂片鏡檢

在顯微鏡油鏡下觀察為單個或呈串狀排列的革蘭陽性球菌（圖2）。

2.3 動物致病性試驗(yàn)

在無菌條件下，剖檢試驗(yàn)組死亡小鼠，進(jìn)行微生物分離培養(yǎng)，結(jié)果顯示，能夠得到與原分離菌株一致的病原菌。

2.4 16S rDNA基因擴(kuò)增結(jié)果

將分離到的菌株，利用16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小約480 bp的目的條帶（圖3）。

2.5 16S rDNA鑒定結(jié)果

將擴(kuò)增產(chǎn)物送至山西恩兆因生物技術(shù)有限公司測序，將測序結(jié)果（序列未公布）與NCBI上其他葡萄球菌參考株16SrDNA基因比對分析，結(jié)果表明，擴(kuò)增序列與NCBI公布的KM010139.1參考株同源性達(dá)100%，證實(shí)該分離株為金黃色葡萄球菌。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

本試驗(yàn)分離的金黃色葡萄球菌對慶大霉素、鏈霉素、多黏菌素B、卡那霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、痢特靈耐藥；對頭孢氨芐、四環(huán)素、頭孢克羅中敏;對阿米卡星、阿莫西林、頭孢曲松、頭孢哌酮敏感（表1）。

表1 34株金黃色葡萄球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本研究確定了山西省該獺兔場因呼吸系統(tǒng)疾病死亡的兔子病因是金黃色葡萄球菌感染，部分有消化道病變，拉水樣糞便。金黃色葡萄球菌作為一類重要的可引起人畜共患的細(xì)菌性疾病的病原菌，對養(yǎng)殖業(yè)及養(yǎng)殖人員安全具有潛在威脅[4-8]。本試驗(yàn)檢測了34株獺兔源金黃色葡萄球菌對臨床常用藥物的敏感性，明確了山西省獺兔源金黃色葡萄球菌分離株的耐藥情況，分離的獺兔源金黃色葡萄球菌對鏈霉素、多黏菌素B、痢特靈、諾氟沙星耐藥性較高（97.05%以上），其次為氧氟沙星（94.12%）、卡那霉素（91.18%）和慶大霉素（91.18%）、四環(huán)素（8.82%），該結(jié)果與王華等[9]報道的兔源金黃色葡萄球菌耐藥情況存在一定差異，表明不同地區(qū)的同種動物源金黃色葡萄球菌耐藥情況存在一定差異，這可能與不同地區(qū)獺兔的飼養(yǎng)、管理方式及飼料中抗生素添加的種類和用量等因素有關(guān)；與王登峰等[10-13]報道的牛源金黃色葡萄球菌耐藥情況相近，表明不同地區(qū)的不同種動物源金黃色葡萄球菌的耐藥情況存在相近性。細(xì)菌的耐藥機(jī)制不是一個獨(dú)立的機(jī)制，是由不同機(jī)制共同協(xié)同而成的[14-17]。因其耐藥機(jī)制的復(fù)雜性，一旦產(chǎn)生耐藥性，將會給獸醫(yī)臨床治療帶來巨大困難，同時引發(fā)公共衛(wèi)生安全問題[18-20]。

本試驗(yàn)為進(jìn)一步探究細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，同時，為本地區(qū)的獺兔金黃色葡萄球菌病的治療提供臨床用藥指導(dǎo)，但并不具有廣泛的通用性和代表性。