農(nóng)桿菌浸蘸柱頭創(chuàng)制高品質(zhì)抗蟲棉研究

吳慎杰 ，李 靜 ，史秀梅 ，張換樣 ，秦麗霞 ，解曉紅 ，楊曉黎，湯飛宇，李燕娥，焦改麗

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所，山西運城044000；2.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山西太原030031；3.江西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，江西南昌330045）

我國絕大多數(shù)原棉適紡32～40支紗，適紡60支紗及以上的高品質(zhì)原棉嚴重缺乏[1]。高品質(zhì)陸地棉即絨長≥31 mm、比強度≥34 cN/tex、整齊度指數(shù)≥83和麥克隆值在3.5～4.5，其可以替代長絨棉紡大于60支的高支紗，相對長絨棉其產(chǎn)量高和生產(chǎn)成本低，可以顯著降低紡織成本，使紡織品的品質(zhì)和價格具有強大競爭優(yōu)勢，深受紡織企業(yè)喜愛。優(yōu)質(zhì)中長絨棉市場需求異常緊俏，據(jù)預測，歐洲每年需求高強力中長絨棉現(xiàn)已增長至450萬t左右，國內(nèi)每年需求40萬～50萬t。“十五”期間，國家將中長絨陸地棉育種列入重點攻關計劃。農(nóng)業(yè)部在2003—2007年出臺了中長絨陸地棉的育種目標。經(jīng)過多年攻關，在新疆、河北、江蘇和江西等地一批新的早熟中長絨棉品種（系）已在田間試驗、示范、推廣中，為我國棉花發(fā)展提供了科技支撐。但是它們大多不抗蟲且豐產(chǎn)性欠佳，而采用回交轉(zhuǎn)育抗蟲基因的方法連鎖累贅，導致選擇效果不理想且年限較長。通過雜種優(yōu)勢利用的途徑，盡管能直接利用外源抗蟲基因，且雜種一代往往具有一定的產(chǎn)量超親優(yōu)勢[2-3]，但纖維品質(zhì)一般，為中親優(yōu)勢[4-6]，于是高品質(zhì)棉與常規(guī)Bt抗蟲棉雜交很難獲得F1為高品質(zhì)的雜交種，其F1產(chǎn)量優(yōu)勢上又不如高品質(zhì)棉品種互交雜種[4-6]。所以，在高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)組合的選育上同時實現(xiàn)抗蟲，需要2個親本均為高品質(zhì)棉且至少有1個親本含有抗蟲基因，利用纖維品質(zhì)平均優(yōu)勢維持F1的纖維品質(zhì)，利用產(chǎn)量超親優(yōu)勢來提高產(chǎn)量，表達抗蟲基因，使F1具有抗蟲性。然而，由于缺乏高品質(zhì)抗蟲資源，極大限制了高品質(zhì)抗蟲雜交棉選育。

本研究以江西和新疆等地的10份高品質(zhì)陸地棉品種（系）為受體，采用農(nóng)桿菌菌液浸蘸棉花柱頭的轉(zhuǎn)化方法，將Bt＋Sck雙價抗蟲基因?qū)胫虚L絨陸地棉的基因組中，純合轉(zhuǎn)基因株系，旨在選出高抗蟲高品質(zhì)品系，作為進一步高品質(zhì)抗蟲雜交棉選育的核心親本，以促進高品質(zhì)抗蟲雜交棉育種發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

轉(zhuǎn)化受體材料為 20166，20412，20458，20448，S31.8-1，316，602，KD52026，新陸中 19 和新陸早 31等10個陸地棉品種（系）。其中，前4個品系由江西農(nóng)業(yè)大學湯飛宇教授提供；S31.8-1是山西省農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所生物技術實驗室泗棉3號組培變異產(chǎn)生的高比強材料，連續(xù)3a纖維比強度測定在37.0以上；其余品種（系）由新疆石河子農(nóng)業(yè)科技開發(fā)研究中心的艾尼江博士提供。所有酶類是從NEB公司訂購，試劑盒DIG DNA Labeling and Detection Kit1購于Roche公司，硫酸卡那霉素由河南潤弘制藥股份有限公司生產(chǎn)（醫(yī)用，2 mL/支，0.5 g/支）。

轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株為LBA4404。雙元植物表達載體PcRPBSck35sBt（由中科院遺傳發(fā)育研究所朱禎研究員提供）攜帶Bt和Sck雙價抗蟲基因，Sck基因由PRPB（棉花曲葉病毒復制蛋白）組成型強啟動子驅(qū)動表達，Bt基因由35s啟動子驅(qū)動，T-DNA區(qū)段含卡那霉素抗性選擇基因nptII[7]。

1.2 試驗方法

1.2.1 轉(zhuǎn)化方法 2009年4月于山西省農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所試驗田種植每個受體材料2行，行長7 m。苗期用卡那霉素進行抗性篩選，避免受體混雜。定苗時每行留20株，于盛花期（7月15—25日）進行轉(zhuǎn)化，見花就做。將攜帶目的基因的農(nóng)桿菌于28℃振蕩培養(yǎng)16～24 h，離心后用轉(zhuǎn)化液（10%的蔗糖、0.5%（V/V）的Silwet L-77和 5 mg/L的 6-BA）重懸至OD600＝0.8～1.0備用。在田間用農(nóng)桿菌菌液浸蘸柱頭法[8-9]，不切割柱頭，于開花當天17：00—19：00直接將菌液涂抹于授粉后的柱頭，改用綁花保濕，將雙價抗蟲基因（Bt＋Sck）導入受體棉花。

1.2.2 卡那霉素抗性篩選 將2009年收獲的轉(zhuǎn)基因種子，于2010年3月5日高密度播種在苗圃上（苗圃用無滴膜搭成拱形，苗床用清洗干凈的細沙鋪成），待棉苗長到3～5片真葉時用4 000 mg/L卡那霉素噴灑，7～10 d拔去葉片明顯發(fā)黃的苗子；再10 d后剩余植株用4 000 mg/L卡那霉素噴灑，進行第2次卡那霉素抗性選擇，2次選擇留下的植株為轉(zhuǎn)基因候選植株[10]。

1.2.3 PCR分析 采用改良的CTAB法[11]提取轉(zhuǎn)基因候選棉株和非轉(zhuǎn)基因棉株的基因組DNA，進行PCR 檢測。Bt引物，F(xiàn)：5′-CACAATCCCACTATC-3′，R：5′-GGACACTGTACGGAT-3′；擴增片段約 900bp。Sck 引物，F(xiàn)：5′-GTGGATCCCACATGTTTG-3′，R：5′-TGCAGGATTTGCAAGCCG-3′；擴增片段約 600 bp。NptII引物，F(xiàn)：5′-GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3′，R：5′-TAGAAGGCGATGCGCTGCGA-3′；擴增片段約750 bp。PCR 擴增體系20 μL。程序為 94℃，5 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，1 min，30 循環(huán)；72℃5 min。取10 μL擴增產(chǎn)物在0.8%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

1.2.4 免疫試紙檢測 用600 μL蒸餾水于1.5 mL離心管中研磨0.1 g的幼嫩葉片，離心后取上清用購自北京銀土地公司的國產(chǎn)BT-Cry1Ab/1AC抗蟲檢測試紙條檢測BT毒蛋白的有無[12]。

1.2.5 Southern blot 提取3個純合株系及各自受體葉片的 DNA（40 μg）[11]，質(zhì)粒和基因組 DNA均使用NEB公司的HindⅢ酶切，用DIG標記從Bt基因擴增片段作為探針進行雜交，擴增片段長900 bp，引物是5′-CACAATCCCACTATC-3′（F）和5′-GGACA CTGTACGGAT-3′（R）。DNA酶切后在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳分離10～16 h，用紙吸印法將DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜（positively charged，Roche）上，Southern雜交的具體操作按Roche公司的地高辛試劑盒（DIG DNA Labeling and Detection Kit1）說明進行。1.2.6 轉(zhuǎn)基因純合株系的選育 利用1.2.2，1.2.3和1.2.4的檢測方法，結(jié)合南繁北育的系統(tǒng)選育手段，連年進行株行種植，如果連續(xù)2代田間均不分離，該株系即為轉(zhuǎn)基因純合系。

1.2.7 純合系的抗蟲性檢測 在棉花花鈴期（7月上旬），分別取雙價抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花的倒2葉和抗蟲棉晉棉50植株相應葉片（對照），參照唐燦明等[13-14]的方法進行抗蟲性鑒定和分級，每株系重復5次。浸濕的脫脂棉包住葉柄，每葉片接種到一個培養(yǎng)皿中，每皿8頭棉鈴蟲初孵幼蟲，用Parafilm膜封口，27℃散射光下飼養(yǎng)7 d，調(diào)查幼蟲數(shù)和棉鈴蟲的死亡率。

1.2.8 純合株系的農(nóng)藝性狀調(diào)查 2011—2012年，在山西省農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所楊保農(nóng)場，純合系于4月15日左右播種，株距36cm，平均行距75cm，7 m行長，3個小區(qū)重復，每小區(qū)每純合系4個株行，隨機區(qū)組排列，栽培管理水平與當?shù)卮筇锷a(chǎn)一致。每小區(qū)每純合系在吐絮期（9月初）隨機取10株棉花，重復3次調(diào)查其第1果枝節(jié)位、果枝數(shù)、單株鈴數(shù)、果節(jié)數(shù)和株高等性狀；每小區(qū)每純合系收正常吐絮20鈴，重復3次考察鈴質(zhì)量和衣分；每小區(qū)每純合系隨機收獲10株所有籽棉并壓榨，重復3次考察單株皮棉產(chǎn)量和籽棉產(chǎn)量。所有指標均為2011，2012年2 a結(jié)果的平均值。

1.2.9 纖維品質(zhì)檢測 考查鈴質(zhì)量和衣分的棉樣送中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所纖檢中心，用HVI900纖維品質(zhì)檢測儀檢測[1]斷裂比強度、馬克隆值、整齊度指數(shù)、伸長率和上半部平均長度等性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)化體的初步篩選

篩選到的卡那霉素抗性植株，上部真葉均沒有黃斑，非轉(zhuǎn)化植株上部真葉有黃斑（圖1）。經(jīng)過連續(xù)2次的卡那霉素抗性篩選獲得卡那霉素抗性植株，進一步對這些植株進行BT免疫試紙的測定，試紙上顯示2條帶的為陽性（圖2-1～6管中的試紙），證明目的基因的蛋白得以表達；只顯示上面一條帶（質(zhì)控線）的為陰性（圖2-第7管中的試紙），不同陽性樣品的檢測線顏色深淺不同，說明它們的毒蛋白含量或表達水平有差異。2次檢測均為陽性即為獲得的轉(zhuǎn)化體，共獲得轉(zhuǎn)化體63株（表1）。筆者認為，在種植密度一致的條件下，以種植小區(qū)面積、種植植株數(shù)目或轉(zhuǎn)化花朵數(shù)為基數(shù)比收獲的種子數(shù)為基數(shù)計算轉(zhuǎn)化效率更具有代表性，因為不同的品系結(jié)實率是不同的，對柱頭所做不同處理直接降低結(jié)實率；而在轉(zhuǎn)化過程中處理之間或品系之間的工作量基本相同。所以，在比較轉(zhuǎn)化效率時，以種植的植株數(shù)40株為基數(shù)，經(jīng)過2次檢測獲得的候選轉(zhuǎn)基因植株的多少即能代表轉(zhuǎn)化的效率，結(jié)果顯示，不同的受體材料的轉(zhuǎn)化效率差異很大，就田間的表型來看，株型較大、營養(yǎng)生長較強的材料轉(zhuǎn)化效率較高（316，S31.8-1，KD52026），具體原因仍有待研究。

表1 各受體獲得的抗性植株數(shù)量

2.2 PCR檢測證明目的基因整合到受體基因組

根據(jù)目的基因和標記基因各設計特異引物，提取2.1獲得的各轉(zhuǎn)化體的基因組DNA，進行標記基因和2個目的基因的擴增驗證，陰性對照（圖3-泳道6）沒有擴增條帶，陽性對照質(zhì)粒（圖3-泳道7）擴增出Bt基因片段，約900 bp，Sck基因片段，約600 bp；NptII基因片段（約 750 bp）；陽性植株（圖3-泳道1～5）與質(zhì)粒對照（圖3-泳道7）能擴增出大小一致的目的條帶，初步表明Bt基因被整合到了受體基因組中。

2.3 Southern blot證明目的基因整合到3個純合系基因組

利用1.2.2，1.2.3和1.2.4的檢測方法，結(jié)合南繁北育的系統(tǒng)選育手段，連續(xù)2代田間均不分離的株系即為轉(zhuǎn)基因純合系。在2010年（海南）和2011年（山西）大田株行選擇中，有3個轉(zhuǎn)化事件經(jīng)卡那霉素抗性篩選、免疫試紙檢測和PCR檢測不再分離，為候選純合株系，提取葉片DNA后，以40 μg轉(zhuǎn)化植株基因組DNA，40μg受體基因組DNA和1～2μg質(zhì)粒DNA進行Southern blot分子檢測。Bt基因的分子雜交顯示，質(zhì)粒DNA有1條接近3.5 kb雜交條帶；其受體S31.8-1（圖4-泳道3）無條帶；轉(zhuǎn)基因純合系S486（圖4-泳道4）有4 000～5 000 bp的2條帶，即2個拷貝，S497（圖4-泳道5）和S498（圖4-泳道6）分別有3 000，2 500 bp左右的單帶，即各自1個拷貝，其受體20448（圖4-泳道7，8）無條帶。證明Bt基因已被整合到3個純合系的基因組中。

2.4 轉(zhuǎn)基因純合株系具有很好的抗蟲性

3個純合株系室內(nèi)抗蟲鑒定結(jié)果顯示，盛花期轉(zhuǎn)Bt＋Sck雙價抗蟲棉株系的棉鈴蟲死亡率都大于90%，抗蟲性顯著高于受體對照，高于或相當于陽性對照抗蟲棉晉棉50的抗蟲水平，轉(zhuǎn)Bt＋Sck雙價抗蟲棉表現(xiàn)出對棉鈴蟲很高的毒殺作用（表2，圖5）。

表2 3個純合株系對棉鈴蟲的抗性分級

2.5 轉(zhuǎn)基因株系維持了和受體相當?shù)睦w維品質(zhì)

纖維品質(zhì)的測定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因純合系與各自的受體間整齊度、絨長、伸長率和比強度無明顯差異，S498和S497的馬克隆值比受體20448低，而S486比受體S31.8-1的馬克隆值高?？梢姡?個轉(zhuǎn)基因純合系維持了和受體基本相當?shù)睦w維品質(zhì)（表3）。

表3 轉(zhuǎn)基因純合系的纖維品質(zhì)測定

2.6 轉(zhuǎn)基因株系的產(chǎn)量性狀明顯優(yōu)于受體

產(chǎn)量性狀調(diào)查顯示，轉(zhuǎn)基因純合株系與各自的受體對照相比，單株鈴數(shù)、單株籽棉產(chǎn)量和單株皮棉產(chǎn)量顯著增加；轉(zhuǎn)基因株系和受體的單鈴質(zhì)量和衣分間差異不顯著，比對照稍有增加（表4）。

表4 轉(zhuǎn)基因純合系的產(chǎn)量性狀

2.7 轉(zhuǎn)基因株系的株型與各自受體相比有明顯改變

轉(zhuǎn)基因純合株系與各自受體對照相比，轉(zhuǎn)基因純合系的株高、第1果枝節(jié)位、果枝數(shù)和單株果節(jié)數(shù)明顯降低（表5），而單株鈴數(shù)顯著增加（表4），所以，單株的成鈴率增加?？赡苁怯捎?5s啟動子組成型表達抗蟲基因，改變了植株的營養(yǎng)分配，使得轉(zhuǎn)基因植株的營養(yǎng)生長受到抑制，生殖生長受到促進，株型和產(chǎn)量性狀得到了明顯改善。

表5 轉(zhuǎn)基因純合系的株型性狀

3 結(jié)論與討論

利用農(nóng)桿菌菌液浸蘸和涂抹柱頭的轉(zhuǎn)化方法，首次直接將Bt＋Sck雙價抗蟲基因?qū)肓烁咂焚|(zhì)棉品系，獲得了多達63個轉(zhuǎn)化事件，經(jīng)系統(tǒng)選擇和可靠的分子檢測，至2011年底獲得了3個高品質(zhì)抗蟲棉純合系，轉(zhuǎn)基因株系具有較高的抗蟲性同時維持了受體的高纖維品質(zhì)。

到 2012年年底，我們通過 1.2.2，1.2.3，1.2.4，1.2.6的檢測和選擇方法獲得了40多個轉(zhuǎn)化事件的純合株系，雖然沒有全部進行Southern檢測，但通過免疫試紙測定，可確證BT毒蛋白都得到了表達。這些轉(zhuǎn)化事件和受體比較，大多轉(zhuǎn)化事件的抗蟲性、產(chǎn)量、品質(zhì)和適應性表現(xiàn)良好，尤其是株型和結(jié)鈴性明顯變好，高品質(zhì)棉營養(yǎng)生長旺盛的缺點得到改良，可能是由于35s啟動子組成型表達BT蛋白，改變了植株的能量分配，但機理需要進一步深入研究。這些純合的轉(zhuǎn)基因材料已經(jīng)返還和提供給受體提供者以及山西省農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所一些課題作為高品質(zhì)抗蟲雜交棉選育的親本使用。

棉花的再生受基因型的限制，同樣的高品質(zhì)棉只有極少基因型可以胚胎發(fā)生，所用的10個受體我們均嘗試了再生體系的構(gòu)建，沒有獲得成功，即高品質(zhì)棉基于胚胎發(fā)生的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系沒有建立[15-16]。針對這一情況，本研究使用了2009年報道的農(nóng)桿菌浸蘸柱頭法這種新的轉(zhuǎn)基因技術[8-9]，同時對該轉(zhuǎn)化方法進行了如1.2.1的改良；與傳統(tǒng)農(nóng)桿菌介導法相比，其更為簡便、經(jīng)濟和高效，避免了組織培養(yǎng)受基因型限制和易產(chǎn)生體細胞無性系變異等問題[17]。該方法建立依耐農(nóng)桿菌棉花傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化棉花花粉[18]、擬南芥花器官浸泡[19]和棉花花粉管通道[20]4種轉(zhuǎn)化方法的結(jié)合。在實驗室通過GUS組織化學分析觀察農(nóng)桿菌侵染下胚軸切面或胚性愈傷時，48 h的瞬時轉(zhuǎn)化率處于12.61～42.8%；農(nóng)桿菌浸泡花粉后授粉會使大部分花粉破裂死亡；花粉落在柱頭上需要萌發(fā)出花粉管伸長到子房完成受精，且細胞核處于花粉管的下段，在這一階段的某一時刻農(nóng)桿菌滴注柱頭表面或柱頭切面，花粉管細胞暴露在柱頭表面或切面也應有12.61～42.8%的概率被侵染，然后在完成受精的同時完成轉(zhuǎn)化；這種假設的T-DNA靶向目標明顯區(qū)分于擬南芥的in planta農(nóng)桿菌侵染過程，擬南芥的in planta轉(zhuǎn)化T-DNA靶向于成熟的雌配子體，轉(zhuǎn)化胚乳細胞和轉(zhuǎn)化胚胎是相對獨立的轉(zhuǎn)化事件[19]。即農(nóng)桿菌侵染了已經(jīng)進入花柱的花粉管細胞進一步到達胚珠，精卵細胞結(jié)合形成了轉(zhuǎn)化的合子，進而發(fā)育成轉(zhuǎn)化的種子，該過程我們現(xiàn)在基本可以確證（未報道）；但是無法排除由花粉管萌發(fā)將農(nóng)桿菌帶入胚珠或農(nóng)桿菌通過花粉管通道進入胚珠的可能。期望進一步提高該方法的轉(zhuǎn)化效率，簡化和標準化轉(zhuǎn)化程序，使之成為大多數(shù)育種工作者的有利工具，促進更多轉(zhuǎn)基因高品質(zhì)棉品種用于生產(chǎn)，確實為我國高品質(zhì)抗蟲雜交棉的選育作出貢獻。