惡性瘧原蟲PfMAg-1對裂殖子入侵功能的影響*

高 雪 王振生 高宇輝 王 恒

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病原生物學(xué)系，北京 100005)

瘧原蟲在宿主紅細(xì)胞內(nèi)經(jīng)裂體增殖過程而導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞、裂殖子釋放入血后的再次入侵其它紅細(xì)胞是造成宿主發(fā)病的原因。在這個(gè)過程中，惡性瘧原蟲裂殖子是唯一游離于紅細(xì)胞存在的形式，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對裂殖子相關(guān)抗原的特異性抗體，并通過補(bǔ)體激活以及調(diào)理作用有效清除裂殖子(Bouharoun-Tayounetal., 1992)。因此，在設(shè)計(jì)紅內(nèi)期瘧疾疫苗時(shí)，瘧原蟲裂殖子表面的抗原多被選用為候選抗原(Crunkhorn, 2018)。

在惡性瘧原蟲裂殖子入侵過程的不同階段，頂膜抗原-1(apical membrane antigen 1，AMA1)、相對分子量為175 kDa的紅細(xì)胞結(jié)合抗原(erythrocyte binding antigen, EBA175)、裂殖子表面蛋白1～8(merozoitesurfase protein, MSP)等微線體、棒狀體蛋白、裂殖子表面蛋白在裂殖子接觸、粘附紅細(xì)胞，內(nèi)陷形成納蟲空泡時(shí)發(fā)揮了關(guān)鍵作用(de Koning-Wardetal., 2003； Chiuetal., 2016)，與裂殖子入侵相關(guān)的蛋白是紅內(nèi)期瘧疾疫苗研發(fā)的重要靶蛋白(Patarroyoetal., 2017)。迄今為止，MSP1是最受關(guān)注的裂殖子表面蛋白之一(Kochetal., 2017; Pauletal., 2018)。研究表明，3～8歲患瘧疾兒童體內(nèi)的抗MSP119抗體能夠有效抑制裂殖子入侵紅細(xì)胞(Rileyetal., 1992)。臨床實(shí)驗(yàn)顯示，將以MSP142為基礎(chǔ)的疫苗FMP1-AS02 A接種馬里的成人后，其體內(nèi)產(chǎn)生的IgG抗體能夠特異性識別惡性瘧原蟲株MSP1蛋白(Theraetal., 2006)，但是將此疫苗接種肯尼亞兒童后卻未產(chǎn)生有效的保護(hù)(Ogutuetal., 2009)。因此，基于單一MSP1的瘧疾疫苗依然存在不足，有必要篩選新的裂殖子相關(guān)蛋白，作為瘧疾疫苗的候選抗原。

pfmag-1是本實(shí)驗(yàn)室利用保護(hù)性單克隆抗體篩選出的惡性瘧原蟲紅內(nèi)期表達(dá)基因。該基因位于惡性瘧原蟲4號染色體，全長2 912 bp，在基因組上僅有一個(gè)拷貝(路妍, 2001)。序列比對分析發(fā)現(xiàn)，pfmag-1基因僅為惡性瘧原蟲所特有，在其他型感染人類的瘧原蟲中均未發(fā)現(xiàn)其全長同源序列，只檢索到PfMAg-1蛋白C端與約氏鼠瘧原蟲的PypAg-1蛋白C端有42%的同源性(高宇輝, 2007)。曾有研究報(bào)道PypAg-1蛋白免疫可以有效降低感染小鼠的蟲血率，延長小鼠的存活時(shí)間(Burnsetal., 1999)。由此推測，PfMAg-1蛋白可能是惡性瘧原蟲表達(dá)的重要蛋白。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究顯示，PfMAg-1蛋白分子量為70.2 kDa，是惡性瘧原蟲裂殖子表面相關(guān)蛋白，在裂殖體晚期表達(dá)，且具有期特異性(高芳明, 2002)。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示PfMAg-1分布在裂殖子細(xì)胞膜表面附近(Gaoetal., 2009)，提示該蛋白與裂殖子入侵紅細(xì)胞過程相關(guān)。瘧原蟲的體外生長抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抗PfMAg-1蛋白C端重組蛋白的抗體對體外培養(yǎng)的惡性瘧原蟲抑制率可達(dá)73%(Gao, 2002)，提示PfMAg-1可能作為瘧疾疫苗的候選抗原。為了進(jìn)一步研究PfMAg-1在惡性瘧原蟲紅內(nèi)期的生物學(xué)作用，本研究利用CRISPR/dCas9技術(shù)構(gòu)建了用于敲低瘧原蟲PfMAg-1表達(dá)的質(zhì)粒，獲得PfMAg-1低水平表達(dá)蟲株。裂殖子入侵實(shí)驗(yàn)證實(shí)PfMAg-1低水平表達(dá)可降低惡性瘧原蟲裂殖子入侵效率，提示PfMAg-1蛋白參與了惡性瘧原蟲裂殖子入侵紅細(xì)胞的過程。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

pCas9-BSD-sgRNA(pCBS)-dCas9Stu1-PfSir2a(上海巴斯德研究所江陸斌教授課題組惠贈)，質(zhì)粒小提試劑盒、qRT-PCR試劑盒(全式金)，限制性內(nèi)切酶、T4連接酶(NEB)，無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(MN)、KOD高保真DNA聚合酶(TOYOBO)，通用型柱式基因組提取試劑盒(北京康為世紀(jì))，膠回收試劑盒(QIAGEN)，無縫克隆試劑盒(南京諾為贊)。

1.2 敲低質(zhì)粒的構(gòu)建

登錄CRISPR RGEN Tools網(wǎng)站(http://www.rgenome.net/)(Cuietal., 2018)，設(shè)計(jì)靶向pfmag-1基因特異性的向?qū)NA(single guide RNA, sgRNA)：A T G C A T G T T T C C G C T G C T TG。根據(jù)同源重組法的原理，設(shè)計(jì)上游引物：5′-A G T A T A T A A T A T T G G T A C G T A T G C A T G T T T C C G C T G C T TG-3′；下游引物：5′-T C T A G C T C T A A A A C A G G C C T C A A G C A G C G G A A A C A T G C AT-3′，并將單鏈互補(bǔ)DNA退火成雙鏈DNA。參照無縫克隆試劑盒說明書，將雙鏈DNA與經(jīng)SnaBⅠ、StuⅠ雙酶切的原始質(zhì)粒pCas9-BSD-sgRNA(pCBS)-dCas9Stu1-PfGCN5連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，并涂抗性(含100 μg/mL氨芐青霉素)平板，在平板上挑取數(shù)個(gè)重組菌，進(jìn)行酶切鑒定并送上海生工生物工程有限公司測序。此為敲低瘧原蟲中pfmag-1基因的質(zhì)粒，記為MAg1KD。

1.3 惡性瘧原蟲的轉(zhuǎn)染

需要轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒：敲低質(zhì)粒MAg1KD、未連接sgRNA的原始質(zhì)粒pCas9-BSD-sgRNA(pCBS)-dCas9Stu1-PfSir2a，作為對照。取蟲血率為5%，生長時(shí)期為14～16 h的環(huán)期瘧原蟲，適量1×Cytomix洗滌2次。電轉(zhuǎn)體系為：含環(huán)期瘧原蟲的紅細(xì)胞100 μL，質(zhì)粒100 μL(質(zhì)粒濃度需稀釋為1 μg/μL)，2×Cytomix 200 μL。將電轉(zhuǎn)混合物轉(zhuǎn)入2 mm電擊杯進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)化參數(shù)為310 V，950 μF，電阻無窮大，狹縫2 mm3。電轉(zhuǎn)完成之后將混合物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，加入適量完全培養(yǎng)基置于37℃三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 轉(zhuǎn)染蟲株的篩選與鑒定

在轉(zhuǎn)染第3 d，瘧原蟲為環(huán)狀體期，且原蟲率達(dá)7%～10%時(shí)，開始使用含2.5 nmol/L BSD的完全培養(yǎng)基至篩選出轉(zhuǎn)染蟲株：敲低株MAg1KD蟲株及對照株Control蟲株。PCR擴(kuò)增藥物篩選基因bsd：陰性對照以3D7蟲株的基因組DNA為模板擴(kuò)增bsd基因；陽性對照以Control蟲株的基因組DNA為模板擴(kuò)增bsd基因，實(shí)驗(yàn)組以MAg1KD蟲株的基因組DNA為模板擴(kuò)增bsd基因。設(shè)計(jì)上游引物：5′-A G C A T C C C C A T C T C T G A A G AC-3′，下游引物為：5′-C A C A T A A C C A G A G G G C A G C AA-3′。參照KOD高保真DNA聚合酶說明書，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min后進(jìn)入循環(huán)；98℃ 10 s，55℃ 30 s，68℃ 15 s，延伸35個(gè)循環(huán)；最后68℃充分延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段并進(jìn)行純化，將純化后的PCR產(chǎn)物送上海生工生物公司測序。

1.5 瘧原蟲中pfmag-1基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測。由于pfmag-1基因在瘧原蟲的裂殖體期高表達(dá)，因此對MAg1KD蟲株與Control蟲株連續(xù)2次同步化，40 h后即為裂殖體時(shí)期，提取MAg1KD蟲株和Control蟲株裂殖體期的總RNA。以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。pfmag-1基因上游引物序列為5′-C G T G C C C T A G T G A G T G C A TG-3′，下游引物序列為5′-C A T C G C T A A A T G C T C A T C A T TG-3，擴(kuò)增片段大小為137 bp；內(nèi)參U6基因的上游引物序列為5′-G G C T C T C T T C G G A G A T G C C G TT-3′，下游引物序列為5′-A A A A A A T T A C A T T C C T T C T C G A A CG-3，擴(kuò)增片段長度為130 bp。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min進(jìn)行預(yù)變性；95℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在ABI7300熒光定量PCR儀上進(jìn)行，設(shè)cDNA樣品3次重復(fù)。利用2-ΔΔCt相對增量法計(jì)算相對表達(dá)量。

1.6 轉(zhuǎn)染蟲株生長曲線的繪制

將篩選得到的轉(zhuǎn)染蟲株擴(kuò)大培養(yǎng)，連續(xù)兩次5%D-山梨醇同步化后，涂片計(jì)算蟲血率。于6孔板中，每孔200 μL含蟲紅細(xì)胞并調(diào)整初始蟲血率為0.1%，以此時(shí)蟲血率數(shù)值為第1 d，以后每隔24 h統(tǒng)計(jì)蟲血率，連續(xù)統(tǒng)計(jì)8 d，統(tǒng)計(jì)期間只更換培養(yǎng)基，不增加或棄去紅細(xì)胞，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。最后以時(shí)間為橫坐標(biāo)，蟲血率數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制轉(zhuǎn)染蟲株的生長曲線。上述轉(zhuǎn)染蟲株生長至40 h時(shí)，為瘧原蟲的裂殖體時(shí)期，各隨機(jī)選擇50個(gè)瘧原蟲，對裂殖體內(nèi)的裂殖子數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，每個(gè)蟲株設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.7 裂殖子入侵紅細(xì)胞能力實(shí)驗(yàn)

富集晚期裂殖體，涂片計(jì)算此時(shí)蟲血率。于6孔板中，每孔200 μL含蟲紅細(xì)胞并調(diào)整初始蟲血率為0.5%，以此為初始時(shí)間，繼續(xù)培養(yǎng)至12 h，此時(shí)為環(huán)狀體時(shí)期，涂片計(jì)算蟲血率，每個(gè)蟲株設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 敲低質(zhì)粒MAg1KD的構(gòu)建

設(shè)計(jì)靶向pfmag-1基因的sgRNA，sgRNA引導(dǎo)dCas9識別靶基因pfmag-1，在dCas9攜帶的抑制蛋白Repressor作用下抑制pfmag-1基因的表達(dá)(圖1)。

圖1 CRISPR/dCas9技術(shù)下調(diào)pfmag-1原理示意圖Fig.1 Schematic of knocking down pfmag-1 by CRISPR/Cas9

2.2 蟲株的轉(zhuǎn)染和鑒定

通過電穿孔技術(shù)將Control質(zhì)粒和MAg1KD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染惡性瘧原蟲3D7蟲株，經(jīng)過40 d BSD藥物篩選獲轉(zhuǎn)染蟲株。為了評價(jià)轉(zhuǎn)染是否成功，利用PCR檢測轉(zhuǎn)染蟲株內(nèi)的Control質(zhì)粒與MAg1KD質(zhì)粒，結(jié)果顯示，PCR成功擴(kuò)增到bsd基因，其特異條帶在瓊脂糖凝膠電泳399 bp位置，與理論長度一致，進(jìn)一步測序結(jié)果表明，序列與BSD編碼序列完全相符，說明Control質(zhì)粒和MAg1KD質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入惡性瘧原蟲3D7蟲株內(nèi)(圖2-A)。為了檢測pfmag-1基因mRNA表達(dá)是否受到調(diào)控，通過qRT-PCR檢測pfmag-1基因的轉(zhuǎn)錄水平。與Control蟲株相比，MAg1KD蟲株轉(zhuǎn)錄水平降低了65.32%，表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.0403)。說明MAg1KD蟲株中PfMAg-1表達(dá)顯著降低(圖2-B)。

圖2 轉(zhuǎn)染蟲株的鑒定Fig.2 Identification of positive strainsA. 藥物篩選基因bsd的PCR鑒定. M：DNA Marker DL2000；1：未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的3D7蟲株；2：轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒Control的蟲株; 3：轉(zhuǎn)染敲低質(zhì)粒MAg1KD的蟲株。B. 裂殖體期pfmag-1基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的qRT-PCR驗(yàn)證。A. PCR identification of bsd. M. DNA Marker DL2000；1∶3D7 strain of untransfected-plasmid; 2：Control strain of control plasmid transfected; 3：MAg1KD strain of knock-down plasmid transfected. B. qRT-PCR validation of transcript levels of pfmag-1 mRNA in schizont stage.

2.3 pfmag-1基因下調(diào)表達(dá)降低裂殖子入侵能力

通過長達(dá)4個(gè)周期的體外培養(yǎng)，觀察繪制MAg1KD蟲株與Control蟲株的生長曲線，結(jié)果顯示，與對照組相比，MAg1KD蟲株的生長速度低44.77%(44.77%±26.20%)(圖3-A)，提示pfmag-1具有上調(diào)瘧原蟲體外增殖的作用。為探究其內(nèi)在原因，本研究觀察了MAg1KD蟲株裂殖子數(shù)目及其入侵功能變化給增殖帶來的影響。裂殖子數(shù)目計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，MAg1KD蟲株與Control蟲株的裂殖子數(shù)目沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.3693)(圖3-B)。裂殖子入侵紅細(xì)胞能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MAg1KD蟲株的蟲血率比對照組Control蟲株低43.31%，即下調(diào)PfMAg-1表達(dá)的瘧原蟲，裂殖體期裂殖子入侵能力顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0369)(圖3-C)。由此，MAg1KD蟲株的體外增殖速率的降低是由裂殖子入侵紅細(xì)胞能力的下降引起的。

圖3 下調(diào)pfmag-1基因降低裂殖子入侵能力Fig.3 Reducing merozoite invasion with knocking down of pfmag-1 geneA. 轉(zhuǎn)染蟲株的生長曲線; B. 轉(zhuǎn)染蟲株的裂殖子數(shù)目實(shí)驗(yàn); C. 轉(zhuǎn)染蟲株的裂殖子入侵實(shí)驗(yàn)。A. Growth curve of transfected strains；B. The number of merozoites in transfectants;C. Invading experiment of the merozoite of transfected strains.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)室利用傳統(tǒng)的同源重組介導(dǎo)的打靶技術(shù)構(gòu)建敲除pfmag-1基因的質(zhì)粒，多次重復(fù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)未能獲得轉(zhuǎn)染蟲株，而相同技術(shù)條件下獲得了對照組pfmif基因敲除的惡性瘧原蟲蟲株(郭莉, 2015)，因此我們認(rèn)為未能獲得pfmag-1基因敲除蟲株可能有兩方面的原因：(1)pfmag-1是惡性瘧原蟲生長的必需基因，敲除該基因會導(dǎo)致瘧原蟲死亡；(2)盡管多次轉(zhuǎn)染，但由于傳統(tǒng)的同源重組介導(dǎo)的打靶技術(shù)的效率較低，僅約10-6(Capecchi, 1989)，且從質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到篩選出特定蟲株需要6～12個(gè)月的時(shí)間，因此不能排除轉(zhuǎn)染技術(shù)未獲成功這一因素。本研究采用了江陸斌實(shí)驗(yàn)室的CRISPR/dCas9技術(shù)。該技術(shù)衍生于CRISPR/Cas9基因操作原理(Simonetal., 2018)，在CRISPR/Cas9基礎(chǔ)上通過點(diǎn)突變的方式將Cas9失活得到dCas9(dead Cas9)，使核酸酶失去切割活性，同時(shí)保留其特異靶向目的基因的功能，通過干擾靶基因的表達(dá)達(dá)到基因表達(dá)調(diào)控的目的(Pulecioetal., 2017)。在本研究中，通過設(shè)計(jì)特定sgRNA使dCas9和pfmag-1結(jié)合，由于dCas9與抑制基因表達(dá)的蛋白融合，從而可以實(shí)現(xiàn)下調(diào)pfmag-1基因的表達(dá)，從而排除上述兩種因素導(dǎo)致的對實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析的不確性，為探究pfmag-1基因的生物學(xué)功能提供了更為有效的技術(shù)手段。

PfMAg-1在紅內(nèi)期惡性瘧原蟲晚期特異性表達(dá)且定位于裂殖子細(xì)胞膜表面，這些特點(diǎn)均提示PfMAg-1在紅內(nèi)期惡性瘧原蟲進(jìn)入裂殖體和裂殖子的發(fā)育繁殖階段中發(fā)揮作用。本研究通過PfMAg-1低表達(dá)蟲株的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)當(dāng)PfMAg-1的表達(dá)水平降低后，惡性瘧原蟲裂殖子入侵紅細(xì)胞的機(jī)會明顯受到抑制，進(jìn)一步表明PfMAg-1具有促進(jìn)裂殖子入侵新的紅細(xì)胞從而升高蟲血率的作用。盡管如此，PfMAg-1在這一過程中的具體分子機(jī)制仍待進(jìn)一步驗(yàn)證。

由于PfMAg-1位于裂殖子膜外，在裂殖子釋放入血及侵入紅細(xì)胞的過程中顯然會被宿主免疫效應(yīng)細(xì)胞識別、遞呈，隨之誘導(dǎo)產(chǎn)生針對PfMAg-1蛋白的特異性抗體，參與裂殖子的清除。鑒于PfMAg-1是惡性瘧原蟲特有的抗原蛋白，在宿主和其他物種中沒有類似物，因此有可能成為瘧疾疫苗的候選靶抗原。

綜上，本研究通過PfMAg-1對紅內(nèi)期惡性瘧原蟲裂殖子入侵功能的探討證實(shí)其在裂殖子入侵紅細(xì)胞時(shí)發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步評價(jià)PfMAg-1蛋白作為潛在瘧疾疫苗候選物的研究奠定了基礎(chǔ)。