rDNA-ITS序列在吸血蠓分子鑒定中的應(yīng)用研究*

王崇財(cái) 陳 敏 楊美瓊 潘林奇 云小云 黃恩炯**

(1.海南國際旅行衛(wèi)生保健中心，海南?？?570100； 2.福建國際旅行衛(wèi)生保健中心，福建福州 350001)

吸血蠓(Biting midges)是醫(yī)學(xué)昆蟲的重要類群之一，在昆蟲分類系統(tǒng)中屬雙翅目(Diptera)蠓科(Ceratopogonidae)。蠓的分類研究距今約有260年歷史，形成了較為成熟的分類體系，但由于其中存在許多具有多處相似特征的隱種(cryptic species)組成的復(fù)合體(complex)或種團(tuán)(group)，僅依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征往往難以進(jìn)行準(zhǔn)確的分類鑒定。因此，尋找可靠的分類鑒定方法，以期快速、準(zhǔn)確地識(shí)別蠓科昆蟲，尤其是吸血蠓，是現(xiàn)代昆蟲分類學(xué)家研究的重要內(nèi)容之一，也是蠓傳疾病防控工作的基礎(chǔ)。

rDNA廣泛分布于各種生物細(xì)胞中，在功能上具有高度的保守性和良好的時(shí)鐘性，其測定序列常用于物種分類和生物間系統(tǒng)發(fā)育的研究，尤其是物種的種間分類研究(Dover，1982；Hillisetal., 1988；Hillisetal., 1991)。ITS是位于rDNA上18S和28S基因之間的區(qū)域片段，包括ITS1和ITS2兩段序列，由于該區(qū)域不加入成熟核糖體，所以受到的選擇壓力較小，進(jìn)化速度較其他區(qū)域快，具有種內(nèi)變異小而種間變異大的特性，加上協(xié)同進(jìn)化作用保證了該片段在基因組不同單元間的一致性，因而適合進(jìn)行各種分子操作，是較理想的種間鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析的遺傳標(biāo)志(Paskewitzetal., 1993; Kuhlsetal., 2005; Lietal., 2008; Niuetal., 2008)。近年來，國內(nèi)外對ITS序列標(biāo)記在蠓科昆蟲中的研究和應(yīng)用越來越多， ITS1和ITS2序列已在蠓類昆蟲的鑒定中發(fā)揮了重要的作用，在一定程度上促進(jìn)了蠓的分類鑒定水平(王飛鵬等，2012)。本研究采用rDNA-ITS(包括ITS1和ITS2基因)對常見庫蠓進(jìn)行分子鑒定研究，探討rDNA-ITS序列在吸血蠓分子鑒定中的適用性，以期初步建立吸血蠓類分子鑒定技術(shù)體系，為吸血蠓的快速鑒定及外來有害生物的識(shí)別提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本

本研究共選用采集自福建、海南、廣西、黑龍江、新疆5個(gè)省份的59個(gè)樣品。標(biāo)本均用95%乙醇浸泡保存，實(shí)驗(yàn)材料均取自蠓的胸段組織。同時(shí)，從GenBank下載13個(gè)庫蠓基因序列，共計(jì)24種庫蠓。詳細(xì)信息見表1。

1.2 ITS基因PCR擴(kuò)增

采用昆蟲基因組DNA提取試劑盒(Insect gDNAMinipre Kit)提取蠓DNA。擴(kuò)增引物參考Perrinetal. (2006)以及Gomulskietal. (2006) 文獻(xiàn)：PanCulF 5′-G T A G G T G A A C C T G C G G A A GG-3′, 28S 5′-A T T T G G G G G T A G T C A C A C AT-3′，引物由上海生工公司合成。PCR反應(yīng)體系：模板10 μL，上下游引物各1 μL，2×MasterMix 25 μL，加ddH2O至總體積50 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 60 s，54℃ 60 s，72℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物，在濃度為1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE。電泳結(jié)束后于DNR BIO-Imaging Systems公司MiniBis凝膠成像儀中觀察、拍照并記錄結(jié)果。

表1 標(biāo)本信息Tab.1 Information of tested specimen

表1(續(xù))Tab.lContinued

種類Species標(biāo)本編號(hào)Species No.采集地Collection site采集日期Collection date刺螫庫蠓Culicoides punctatusC. punctatus_1福建戴云山Daiyunshan, Fujian2013-05-25C. punctatus_2福建戴云山Daiyunshan, Fujian2013-05-25C. punctatus_3福建戴云山Daiyunshan, Fujian2013-05-25C. punctatus_4福建戴云山Daiyunshan, Fujian2013-05-23C. punctatus_5福建戴云山Daiyunshan, Fujian2013-05-23C. punctatus_6福建戴云山Daiyunshan, Fujian2013-05-23C. punctatus_7福建戴云山Daiyunshan, Fujian2013-05-23C. punctatus_8黑龍江遜克Xunke, Heilongjiang2012-08-01C. punctatus_9黑龍江遜克Xunke, Heilongjiang2012-08-01C. punctatus_10黑龍江遜克Xunke, Heilongjiang2012-08-01C. punctatus_giAB462275-曲囊?guī)祗稢ulicoides puncticollisC. puncticollis_1新疆阿拉山口Alashankou, Xinjiang2012-08-22C. puncticollis_2新疆阿拉山口Alashankou, Xinjiang2012-08-22琉球庫蠓 Culicoides actoniC. actoni_giAB462259-短跗庫蠓 Culicoides brevitarsisC. brevitarsis_giAB462261-多孔庫蠓 Culicoides cylindratusC. cylindratus_giAB462268-殘肢庫蠓 Culicoides imicolaC. imicola_giAF074019-條帶庫蠓 Culicoides maculatusC. maculatus_giAB462263-蘇格蘭庫蠓 Culicoides scoticusC. scoticus_giJF280793-累贅庫蠓 Culicoides verbosusC. verbosus_giAB462281-和田庫蠓 Culicoides wadaiC. wadai_giAB462264-北域細(xì)蠓 Leptoconops borealisLeptoconops borealis青海格爾木Ge 'ermu, Qinghai2014-06-05

1.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的純化與基因測序

采用OMEGA凝膠回收試劑盒(E. Z. N.A. Gel Extraction Kit-200 Preps)對本實(shí)驗(yàn)中的所有樣品進(jìn)行切膠回收、純化以及分子克隆，將克隆子轉(zhuǎn)接試管液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，保存并送測序。每個(gè)菌液樣品由上海生工生物工程有限公司測序，所有的樣品均雙向測序。

1.4 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育分析

用DNAMAN、BioEdit、Clustal W、MEGA、TNT、MrBayes等軟件進(jìn)行序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 ITS基因的序列特征

本研究共獲得16種常見庫蠓59條ITS基因序列。將所得序列與GenBank收錄的庫蠓基因序列進(jìn)行同源性比對。結(jié)果表明測序獲得序列與GenBank上相同拉丁學(xué)名蠓種的基因序列相似性均達(dá)99.8%以上，證明其確為同一蠓種。共計(jì)24種庫蠓72條序列經(jīng)多序列比對后用于分析的序列總長度為917 bp(不含引物)。MEGA的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，其中有326個(gè)保守位點(diǎn)，566個(gè)可變位點(diǎn)，484個(gè)簡約信息位點(diǎn)，82個(gè)單態(tài)位點(diǎn)。T、C、A、G的平均含量分別為：33.95%、14.77%、32.20%、19.08%，A+T的含量(66.15%)明顯高于C+G的含量(33.85%)。轉(zhuǎn)換明顯低于顛換，轉(zhuǎn)換/顛換平均值為0.74。

2.2 遺傳距離

應(yīng)用MEGA計(jì)算不同庫蠓種內(nèi)與種間的遺傳距離。采用的方法為K2P雙參數(shù)模型(Kimura 2-Parameter Model)，對空位兩兩刪除(Pairwise deletion)。結(jié)果顯示，不同庫蠓的種內(nèi)遺傳距離為0～0.13，平均距離為0.07；種間遺傳距離0.05～0.39，平均遺傳距離為0.25(表2)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育

對本實(shí)驗(yàn)所用24種庫蠓進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究，選取北域細(xì)蠓Leptoconopsborealis作為外群。在系統(tǒng)發(fā)育分析前，對本實(shí)驗(yàn)ITS數(shù)據(jù)集進(jìn)行飽和性檢測，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)換和顛換上都不存在飽和，該數(shù)據(jù)集適于系統(tǒng)發(fā)育分析(圖1)。

圖1 ITS轉(zhuǎn)換顛換數(shù)與F84距離的關(guān)系Fig.1 Relationship between transition and transversion and F84 distances 轉(zhuǎn)換值；v 顛換值。s Transition；v Transversion.

本實(shí)驗(yàn)采用Neighbor-joining (NJ)鄰接法、Maximum Pasimony (MP)簡約法和Bayesian (BI) 貝葉斯法分別構(gòu)建NJ樹(圖2)、MP樹(圖3)、BI樹(圖4)。NJ樹由MEGA構(gòu)建，方法采用基于K2P核苷酸替代模型，Bootstrap法1000次自展進(jìn)行檢驗(yàn)。利用TNT軟件構(gòu)建MP樹。貝葉斯法利用jModelTest測驗(yàn)核苷酸替代模型，基于BIC原則(Bayesian Information Criterion)選擇最佳模型HKY+G，位點(diǎn)速率變異設(shè)置為γ分布，同時(shí)建立4個(gè)馬爾科夫鏈，以隨機(jī)樹為起始樹，每100代抽樣1次，直至分列頻率平均標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.01后停止運(yùn)算。

從結(jié)果可以看出，三種算法的的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本相似，表明所有的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果較為穩(wěn)定和可靠。僅以NJ法為主敘述其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。從NJ法系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類結(jié)果可以看出，同個(gè)亞屬的不同種類都先聚類在一起，共有7個(gè)亞屬，形成2大分支。分別為包含有二囊亞屬Avaritia、屋室亞屬Oecacta、單囊亞屬M(fèi)onoculicoides、庫蠓亞屬Culicoides的18個(gè)庫蠓種組成的分支Ⅰ；以及包含有三囊亞屬Trithecoides、傲蠓亞屬Fastus和帶紋亞屬Beltranmyis的分支Ⅱ。在分支Ⅰ中，二囊亞屬與屋室亞屬和單囊亞屬s關(guān)系最近，與庫蠓亞屬關(guān)系最遠(yuǎn)；屋室亞屬和單囊亞屬為姐妹群。在分支Ⅱ中，傲蠓亞屬和帶紋亞屬為姐妹群，與三囊亞屬形成并系群。由樹型上顯示，大部分蠓種的種內(nèi)同源性均相當(dāng)高，且各自形成單系群，但也有幾處的使得這些種類形成并系群，分別是灰黑庫蠓C.pulicarlis_3和C.pulicarlis_5脫離于其他灰黑庫蠓復(fù)合組，而與外群的親緣關(guān)系最近；C.pulicarlis_7落于帶紋亞屬中的荒川庫蠓和環(huán)斑庫蠓之間；C.brevipalpis_1落于傲蠓亞屬Fastus和帶紋亞屬之間。

圖2 基于ITS基因構(gòu)建的NJ樹Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS genes by Neighbor-Joining

圖3 基于ITS基因構(gòu)建的MP樹Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS genes by Maximum Parsimony

圖4 基于ITS基因構(gòu)建的BI樹Fig.4 Phylogenetic tree based on ITS genes by Bayesian Inference

3 討論

本研究以福建、海南等省常見庫蠓為研究對象，構(gòu)建了基于ITS基因的庫蠓分子鑒定體系。24種庫蠓的種間遺傳距離為0.05～0.39，平均遺傳距離0.25；種內(nèi)遺傳距離為0～0.13，平均遺傳距離0.07。種間遺傳距離為種內(nèi)遺傳距離的3.57倍，表明ITS具有較大的種間甚至種內(nèi)變異性，是特異檢測系統(tǒng)的理想靶標(biāo)基因，提示了基于ITS基因的分子標(biāo)記可以用于庫蠓的種類鑒定，具有一定的應(yīng)用前景。

從系統(tǒng)發(fā)育的結(jié)果可以看出，本研究所得的同一亞屬的不同蠓種優(yōu)于不同亞屬蠓種聚類于同一分支，這與遺傳距離分析中種間平均距離遠(yuǎn)大于種內(nèi)平均距離的結(jié)果相符；不過，在支系Ⅰ中，多孔庫蠓和累贅庫蠓為姐妹群，沒有與同亞屬的蠓種聚類在一起，而與標(biāo)翅庫蠓形成并系群，但由于標(biāo)本數(shù)量有限且2個(gè)標(biāo)本均來自GenBank，無法查驗(yàn)標(biāo)本，其準(zhǔn)確的分類地位還有待進(jìn)一步討論。除了同個(gè)亞屬的蠓種能夠較為準(zhǔn)確的聚類，絕大多數(shù)庫蠓的種內(nèi)同源性也都較高，在發(fā)育樹上各自形成單系群且有較高的置信值(圖2)，這與遺傳距離分析中種內(nèi)遺傳差距僅為0.071的結(jié)果相符。這些結(jié)果都從分子生物學(xué)角度驗(yàn)證了形態(tài)分類學(xué)結(jié)果，也驗(yàn)證了真核生物ITS序列具有高度變異性的特點(diǎn)，在物種進(jìn)化和遺傳關(guān)系研究中具有重要的價(jià)值。

盡管本研究中采用ITS單基因標(biāo)記對灰黑庫蠓的鑒定結(jié)果不甚理想，這可能是由于ITS變異速度快，種內(nèi)基因變異大的原因所致，且灰黑庫蠓復(fù)合組一直是困擾國際蠓科分類學(xué)者的重要難題(Lassenetal., 2012)，大的種內(nèi)變異亦暗示著隱存種存在的可能(Gomulskietal., 2006; Pagesetal., 2009)。分子系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類的結(jié)果存在偏差，固然與所選序列片段存在局限性有關(guān)，形態(tài)鑒別特征的不科學(xué)或者是主觀性也可能是造成這種混亂的原因之一。

當(dāng)今，國內(nèi)外學(xué)者對吸血蠓的分子分類已做了大量研究工作，都仍處研究階段，各種分子分類應(yīng)用的靶標(biāo)基因有優(yōu)點(diǎn)也存在其一定的局限性。核糖體DNA上的ITS區(qū)域序列進(jìn)化速度快，在物種水平上變異較大，序列多態(tài)性強(qiáng)并含有足量的遺傳信息，已被廣泛用于物種分類及系統(tǒng)進(jìn)化研究，但是這些基因中存在大量的插入和缺失現(xiàn)象，從而使序列比對受到障礙、不便操作，而且還容易造成錯(cuò)誤的比對(Liuetal.，2010)。基于線粒體基因編碼的DNA條形碼技術(shù)及其應(yīng)用前景雖被眾多學(xué)者所看好，但也有學(xué)者認(rèn)為如此短的DNA片段不能提供物種水平的可靠信息,完全依靠DNA條形碼會(huì)導(dǎo)致鑒定錯(cuò)誤(Willetal., 2004; Ebachetal., 2005)。因此，在利用任何一個(gè)基因或多個(gè)基因片段進(jìn)行物種分類和種屬鑒定時(shí),不能只考慮所選用標(biāo)記基因的片段長度，而應(yīng)該結(jié)合樣本來源、鑒定者、序列組成及其同源性等綜合評(píng)價(jià)。

今后，在形態(tài)學(xué)分類的基礎(chǔ)上，應(yīng)該著力探索、嘗試新的分子標(biāo)記及多個(gè)分子標(biāo)記相結(jié)合，多層次、多方面、系統(tǒng)地研究吸血蠓分類，可較大程度地解決傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類方法的缺陷，更為“真實(shí)”地反映吸血蠓的種群進(jìn)化和親緣關(guān)系。