日本血吸蟲成蟲抗原通過ROS誘導人LX-2肝星狀細胞NLRP3炎癥小體活化和膠原表達*

朱燕楠 繆婷婷 王 偉 陸忠奎 劉勁峰 王 勇

(南京醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病原生物學系，江蘇省現(xiàn)代病原生物學重點實驗室，江蘇南京 211100)

我國是日本血吸蟲的主要流行區(qū)，到2016年底，全國仍有54 454例血吸蟲病患者 (張利娟等, 2017)。終宿主感染日本血吸蟲后，尾蚴會穿透皮膚，通過循環(huán)系統(tǒng)遷移至門靜脈系統(tǒng)，在此發(fā)育成熟并產(chǎn)卵 (Ressurreicaoetal., 2016)。沉積在肝臟的蟲卵分泌的抗原可以誘導肝臟蟲卵肉芽腫的形成和局部炎癥損傷，最終誘發(fā)肝纖維化 (Fernandez-Delgadoetal., 2017; Yamabeetal., 2017)。對血吸蟲病患者或小鼠進行有效殺蟲后，不能完全阻止卵肉芽腫炎癥和肝纖維化的發(fā)展，這可能是由于慢性炎癥過程仍舊持續(xù) (Ciolietal., 2003; Southgateetal., 2005; Gryseelsetal., 2006)。然而，在血吸蟲感染期間，肝臟中介導這種持續(xù)炎癥的機制一直沒有得到很好的解釋。

2002年Martinon等人首次提出了炎癥小體的概念 (Martinonetal., 2002)。炎癥小體是由多種蛋白組成的復合體，現(xiàn)已鑒定了許多炎癥小體，包括NLRP1、NLRP2、NLRP3以及HIN200家族蛋白(如AIM2)等 (Ozakietal., 2015)。炎性小體可以介導機體對各種組織的炎癥反應，是細胞內(nèi)炎癥機制的開關 (Lamkanfietal., 2014)。NLRP3炎癥小體是被最廣泛研究的炎癥小體，在肝臟炎癥和纖維化致病中發(fā)揮著重要的作用 (Schroderetal., 2010)。最近的研究表明，血吸蟲感染小鼠肝星狀細胞(hepetic stellate cells, HSCs)中存在NLRP3炎癥小體激活，這可能作為早期機制來啟動炎癥反應，從而誘發(fā)肝纖維化 (Mengetal., 2016)。然而本實驗室之前的研究發(fā)現(xiàn)，血吸蟲感染早期(蟲卵未產(chǎn)生之前)HSCs已經(jīng)活化并表達大部分趨化因子，同時肝組織中炎性細胞已經(jīng)開始浸潤 (Liangetal., 2012)。血吸蟲感染早期形成的肝臟炎性微環(huán)境對蟲卵肉芽腫的形成以及纖維化相關細胞的活化和基因表達有著重要的作用 (Amirietal., 1992; Leptaketal., 1997; Liangetal., 2011)。但是，對于蟲卵產(chǎn)生之前，肝臟炎癥產(chǎn)生和持續(xù)的機制仍知之甚少。蟲卵產(chǎn)生之前，血吸蟲成蟲抗原SWA被認為是對宿主肝臟產(chǎn)生免疫影響的主要抗原。因此，深入研究SWA對HSCs的活化作用以及可能機制，對全面認識血吸蟲病致病機制有重要意義。

本實驗旨在確定SWA體外刺激是否可以激活人肝星狀細胞系LX-2中NLRP3炎癥小體活化和膠原表達，在此基礎上探討了ROS在其中的作用。本研究有助于我們了解血吸蟲感染早期肝臟內(nèi)炎癥形成的機制，更全面認識血吸蟲感染過程中NLRP3炎癥小體對HSCs活化及炎癥微環(huán)境形成中的作用，為進一步闡明血吸蟲病的致病機制提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞系

人肝星狀細胞系LX-2從中南大學湘雅醫(yī)學院獲得。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(FCS)、青霉素/鏈霉素和胰酶均購自美國Gibco公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，PrimeScriptTMRT Master Mix購自日本TaKaRa公司，RealUniversal彩色熒光定量預混試劑購自天根生化科技公司，引物均由Invitrogen(上海)貿(mào)易有限公司合成，BCA Protein assay Regent Kit購自美國Thermo公司，Caspase-1抗體和H2DCF-DA熒光探針均購自美國sigma公司，PMSF、ECL化學發(fā)光試劑盒、CCK-8細胞活力檢測試劑盒和LDH檢測試劑盒均購自中國碧云天公司，Human IL-1β ELISA檢測試劑盒購自中國達科為公司，NLRP3抗體、β-actine抗體和HRP-兔抗鼠二抗均購自美國CST公司，α-SMA抗體和ColⅠ抗體購自美國abcam公司

1.3 主要儀器

Nano Drop超微量樣本分光光度計產(chǎn)自美國Thermo Scientific公司，Roche Real Time PCR儀產(chǎn)自美國Roche公司，F(xiàn)ACS Carlibur流式細胞儀產(chǎn)自美國BD Bioscience公司，全自動酶標儀產(chǎn)自美國BioTec公司。

1.4 血吸蟲成蟲抗原制備

取適量凍干日本血吸蟲蟲體置研缽內(nèi)碾磨成粉(冰上操作)，加適量PBS，轉移至1.5 mL EP管中，-20℃冰箱過夜，常溫下融化后，使用100 W超聲粉碎共6次每次10 s，之后將其放入-80℃冰箱凍存過夜，反復凍融3次，置室溫充分融化后，混勻，4℃、10 000 g離心25 min；取上清即為SWA，無菌過濾至無菌1.5 mL EP管中；取5 μL，按照BCA試劑盒說明書檢測蛋白濃度，其余的分裝，-80℃凍存。

1.5 細胞培養(yǎng)

將LX-2細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞生長至培養(yǎng)皿的 70%～80% 左右，胰酶消化，以1∶3傳代。取對數(shù)生長期細胞進行鋪板，用于相關實驗。

1.6 抗原刺激

細胞計數(shù)后用DMEM完全培養(yǎng)基將細胞調(diào)節(jié)至5×105/mL，用相應的SWA刺激培養(yǎng)相應的時間，以未經(jīng)抗原刺激的PBS作為對照組。每組細胞至少重復4孔，收集上清和細胞后進行后續(xù)檢測。

1.7 RNA抽提和實時熒光定量PCR檢測

細胞進行相應刺激，24 h后，按照TRIZOL說明書所給的方法提取LX-2細胞中的總RNA，使用Nano Drop超微量樣本分光光度計測量RNA的含量和純度(A260/280吸光值在1.8～2.0之間)。之后按照PrimeScriptTMRT Master Mix說明書將總RNA反轉錄成cDNA。根據(jù)美國生物信息中心(NCBI)人類mRNA序列用Primer 5.0設計引物，引物序列見表1，由Invitrogen(上海)貿(mào)易有限公司合成。應用SYBR Green法進行熒光定量PCR，以GAPDH作為內(nèi)參，反應體系為：(GAPDH、NLRP3、Caspase-1、α-SMA和ColⅠ)上、下游引物濃度0.3 μmmoL、模板約為500 ng、SYBR Green Mix 10 μL、DEPC水加至20 μL；參數(shù)設定為：95℃ 15 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，45個循環(huán)。擴增階段進行熒光信號收集，并在擴增完畢后進行溶解曲線的測定，采用2-ΔΔCt法計算差異倍數(shù)。

1.8 Western blot測定

對細胞進行相應刺激，48 h后，棄去培養(yǎng)基，加入預冷的PBS漂洗2次，棄去上清，每孔加入100～120 μL RIPA裂解液(之前已經(jīng)按照相應比例加入蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和PMSF)，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，將上清(即為細胞總蛋白)轉移至預冷的離心管中，使用BCA法檢測蛋白濃度。加入loading buffer，煮沸5 min變性，SDS-PAGE凝膠電泳，每孔加40 μg蛋白樣品，轉至PVDF膜，轉膜后將PVDF膜放入封閉液中，脫色搖床上搖動封閉2 h，加入一抗(NLRP3，1∶1 000；Caspase-1，1∶1 000；α-SMA，0.5 μg/mL；ColⅠ，1∶2 000；β-actine，1∶1 000)，4℃搖床上孵育過夜，TBST洗滌3次，每次7 min，加入HRP標記的相應二抗，搖床上室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次7 min。

表1 實時定量PCR特異性引物序列Tab.1 Sequences of gene-specific primers for real time PCR assays

1.9 ELISA檢測細胞IL-1β分泌

按1.6方法對細胞進行刺激，72 h后，取上清液，按照Human IL-1β ELISA檢測試劑盒說明書進行檢測，基本步驟為：試劑盒室溫平衡20 min，將標準品倍比稀釋為：0、15.5、31、62.5、125 pg/mL。按照實驗要求，加入標準品和樣品，加檢測抗體，震蕩混勻，蓋上封板膜，37℃溫育90 min。洗板5次，加HRP-鏈霉親和素。蓋上封板膜，37℃溫育30 min，洗板5次。 加入TMB，37℃避光溫育約20 min進行顯色，終止液終止反應。在酶標儀上，讀取檢測波長450 nm和校正波長610～630 nm處讀取各孔吸光度值并繪標準曲線，計算各孔細胞因子濃度。

1.10 CCK-8法檢測細胞活性

收集細胞，用DPBS洗一遍，計數(shù)后完全DMEM培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)節(jié)至5×105/mL，以每孔100 μL的體積加至96孔板中。設置5組：PBS組、SWA (25、50、100 μg/mL)組，空白對照組。每組設置4個復孔。37℃，5% CO2，細胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，于檢測前4 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液。繼續(xù)孵育0.5～4 h，在0.5、1、2和4 h后分別用酶標儀檢測在450 nm和大于600 nm的波長的吸光度。按細胞活率=(檢測孔-空白孔)/(對照孔-空白孔)計算細胞活率。

1.11 檢測細胞LDH實驗

將各培養(yǎng)孔分成如下幾組：無細胞的培養(yǎng)液孔 (背景空白對照孔)，未經(jīng)藥物處理的對照細胞孔 (樣品對照孔)，未經(jīng)藥物處理的用于后續(xù)裂解的細胞孔 (樣品最大酶活性對照孔)，以及SWA (25、50、00 μg/mL)組。每組設置5個復孔。細胞貼壁后用DPBS洗滌一次，使用含1%血清的低血清培養(yǎng)液，37℃、5% CO2，細胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照細胞LDH檢測試劑盒說明書進行檢測。細胞LDH釋放(%)=(處理樣本吸光度-樣本對照孔吸光度)/(細胞最大酶活性的吸光度-樣品對照孔吸光度)×100。

1.12 NAC抑制細胞內(nèi)氧化應激實驗

取對數(shù)生長期的LX-2細胞，分為對照組、NAC (N-乙酰半胱氨酸，N-acetylcysteine)組、SWA組、SWA+NAC組。NAC組和SWA+NAC組在刺激前30 min，每孔加入10 μmol/L NAC。每組4個復孔，之后加入相應刺激，放入37℃，5% CO2，細胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)相應時間。提取細胞RNA、蛋白和上清進行相關檢測。

1.13 細胞內(nèi)活性氧檢測實驗

細胞按照合適的密度接種至培養(yǎng)板中，細胞完全貼壁后，DMEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h。細胞分為2組：對照組和SWA組。繼續(xù)正常培養(yǎng)24 h。去上清，用PBS漂洗2遍，加入含有10 μmol/L H2DCF-DA熒光探針的無血清DMEM培養(yǎng)液1 mL，37℃避光孵育20 min。PBS漂洗1次，胰酶消化細胞離心，使用PBS洗滌2次，加入1 mL PBS重懸細胞，吹打均勻，轉移至流式管中。30 min內(nèi)上流式檢測，以激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長535 nm檢測細胞內(nèi)ROS水平。

1.14 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 SWA刺激LX-2細胞后NLRP3、IL-1β、Caspase-1、α-SMA和ColⅠ mRNA的表達變化

如圖1所示，采用25、50、100 μg/mL等不同濃度SWA刺激LX-2細胞24 h后，熒光定量PCR分析顯示，當SWA濃度為100 μg/mL時，NLRP3炎癥小體及其下游的Caspase-1和IL-1β的mRNA表達水平與對照組相比顯著升高(P<0.05)，同時發(fā)現(xiàn)LX-2細胞活化標志α-SMA和纖維化相關的ColⅠ基因的表達也顯著升高(P<0.05)。

圖1 SWA刺激LX-2細胞對NLRP3、IL-1β、Caspase-1、α-SMA和ColⅠ的mRNA的影響Fig.1 Effects of SWA stimulation on mRNA expression of NLRP3, Caspase-1, α-SMA and ColⅠ in LX-2 cells與對照組相比，*P<0.05；**P<0.01。 n=4。Compared with untreated control group, *P<0.05; **P<0.01. n=4.

圖2 SWA對LX-2細胞NLRP3、Cleaved-Caspase-1、α-SMA和ColⅠ蛋白表達的影響Fig.2 Effects of SWA stimulation on protein expression of NLRP3, Cleaved-Caspase-1, α-SMA and ColⅠ in LX-2 cells與對照組相比，*P<0.05；**P<0.01。Compared with untreated control group, *P<0.05; **P<0.01.

蛋白表達水平上，100 μg/mL濃度的SWA刺激均可以顯著增加細胞NLRP3、Cleaved-Caspase-1、α-SMA和ColⅠ蛋白的表達，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)。

采用ELISA法檢測100 μg/mL濃度的SWA刺激后細胞培養(yǎng)上清中IL-1β的水平，結果顯示LX-2細胞IL-1β的分泌明顯增加，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果見圖3。以上結果表明，SWA可以刺激LX-2細胞內(nèi)NLRP3炎癥小體活化，并誘導膠原生產(chǎn)。

2.2 SWA誘導LX-2細胞發(fā)生細胞焦亡

采用CCK-8檢測SWA對LX-2細胞活力的影響，結果顯示，隨著SWA濃度的增加，LX-2細胞的活力逐漸下降(圖4-A)。LDH檢測結果顯示，LX-2細胞LDH的釋放隨著SWA濃度的增加而增多(圖4-B)。我們進一步檢測了引起細胞焦亡的關鍵分子活化Caspase-1酶(Cleaved- Caspase-1)的表達，結果顯示，當SWA濃度為100 μg/mL時，活化Caspase-1表達顯著上升(P<0.05)(圖4-C)。以上結果表明，SWA可以誘發(fā)LX-2細胞焦亡。

圖3 SWA刺激對LX-2細胞IL-1β分泌的影響Fig.3 Effects of SWA stimulation on IL-1β production in LX-2 cells與對照組相比，*P<0.05。n=4。Compared with control group, *P<0.05. n=4.

圖5 SWA刺激對LX-2細胞ROS釋放的影響Fig.5 The expression of ROS in LX-2 cells infected with SWA與對照組相比，***P<0.001。n=4。Compared with control group, ***P<0.001. n=4.

圖4 SWA誘導LX-2細胞焦亡Fig.4 SWA promotes pyroptosis in LX-2 cellsA. CCK-8法檢測SWA對LX-2細胞活力的影響；B. LDH法檢測SWA對LX-2細胞毒性的影響；C. SWA對LX-2細胞Cleaved-Caspase-1蛋白表達的影響。與對照組相比，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；與50 μg/mL SWA組相比，###P<0.001。n=4。A. Effects of SWA on cell viability in LX-2 cells by CCK-8 assay; B. Effects of SWA on Cytotoxicity in LX-2 cells by LDH assay; C. The protein levels of Cleaved-Caspase-1 in LX-2 cells infected with SWA. Compared with untreated control group, *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; Compared with 50 μg/mL SWA group, ###P<0.001. n=4.

圖6 NAC 抑制SWA誘導的LX-2細胞內(nèi)NLRP3、IL-1β、Caspase-1、α-SMA、ColⅠ 的表達Fig.6 NAC inhibits SWA-induced the expression of NLRP3, IL-1β, Caspase-1, α-SMA and ColⅠ in LX-2 cellsA. NAC抑制ROS后SWA誘導LX-2細胞內(nèi)NLRP3、IL-1β、Caspase-1、α-SMA、ColⅠ mRNA的表達; B. NAC抑制ROS后SWA誘導LX-2細胞內(nèi)NLRP3、Caspase-1、α-SMA、ColⅠ蛋白的表達; C. NAC抑制ROS后SWA誘導LX-2細胞IL-1β的分泌. 與對照組相比，*P<0.05；**P<0.01；SWA組與SWA+NAC組，#P<0.05； ##P<0.01；###P<0.001。n=4。A: Effect of NAC on the mRNA expression of NLRP3, IL-1β, Caspase-1, α-SMA and ColⅠ in LX-2 cells induced by SWA; B: Effect of NAC on the protein expression of NLRP3, Cleaved-Caspase-1, α-SMA and ColⅠ in LX-2 cells induced by SWA; C. Effect of NAC on IL-1β production in LX-2 cells in LX-2 Cells induced by SWA. Compared with control group, *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. SWA group vs SWA+NAC group, #P<0.05; ##P<0.01; ###P<0.001. n=4.

2.3 SWA誘導LX-2細胞ROS反應并介導NLRP3炎癥小體活化和纖維化基因表達

細胞內(nèi)ROS水平檢測結果顯示，SWA刺激可以顯著上調(diào)LX-2細胞中ROS的水平，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5。為進一步證明ROS反應對炎癥小體活化的影響，采用ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)抑制LX-2細胞內(nèi)氧化應激反應，觀察到NAC可以降低細胞內(nèi)NLRP3、IL-1β、Caspase-1、α-SMA和ColⅠ的mRNA和蛋白表達(P<0.05)(圖6-A、6-B)，同時可抑制LX-2細胞IL-1β的表達(P<0.05)(圖6-C)。以上結果均說明，抑制ROS可以抑制LX-2細胞內(nèi)NLRP3炎癥小體活化和膠原表達，提示我們SWA可能是通過ROS誘發(fā)NLRP3炎癥小體的形成，增加炎性細胞因子的釋放導致肝臟局部炎癥微環(huán)境的形成，最終引起肝臟纖維化。

3 討論

NLRP3炎癥小體是一種多蛋白復合物，炎癥小體及其下游效應因子在肝臟炎癥和肝纖維化發(fā)展中發(fā)揮著中心作用，靶向阻斷該復合物可能是阻止或逆轉纖維化發(fā)展的可行性策略 (Wreeetal., 2014；Mridhaetal., 2017)?，F(xiàn)已知在日本血吸蟲感染小鼠中HSCs中存在NLRP3炎癥小體的活化，并且肝臟炎癥與肝纖維化密切相關 (Mengetal., 2016; 溫鎮(zhèn)成等, 2017)。但這些研究均基于血吸蟲蟲卵沉積后的階段進行的研究。事實上，在血吸蟲成蟲成熟至產(chǎn)卵前，肝臟炎性因子TNF-α的表達水平就已經(jīng)顯著上升，并已啟動形成肉芽腫的炎癥反應 (Amirietal., 1992; Leptaketal., 1997; Liangetal., 2012)。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，血吸蟲感染3周小鼠的肝臟中，雖然蟲卵肉芽腫還未形成，卻已經(jīng)可以觀察到炎性細胞浸潤；同時發(fā)現(xiàn)HSCs已經(jīng)開始活化，即α-SMA、膠原的基因表達水平開始上升(數(shù)據(jù)暫未發(fā)表)。而此時，蟲源性的刺激因素主要是SWA。目前，對于SWA對HSCs中NLRP3炎癥小體的活化和纖維化的影響還尚未有相關報道。本實驗我們使用不同濃度SWA體外刺激LX-2細胞，發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體表達上升，其下游活化的Caspase-1表達和IL-1β的分泌也升高。結果表明，LX-2細胞中NLRP3炎癥小體可以被SWA活化，同時發(fā)現(xiàn)SWA可以誘導LX-2細胞活化(α-SMA的基因和蛋白水平上升)和膠原沉積(ColⅠ的基因和蛋白水平上升)。結果提示，在血吸蟲感染致肝臟疾病中，血吸蟲成蟲抗原SWA也可能是HSCs中NLRP3炎癥小體活化和膠原沉積的重要蟲源性因素。

炎癥小體形成所觸發(fā)的炎癥相關的細胞死亡過程被稱為細胞焦亡 (Zhongetal., 2013；Jorgensenetal., 2015)。這個過程涉及Caspase-1的活化，IL-1β等細胞因子的形成，繼而募集、激活其他免疫細胞，誘導趨化因子、炎癥因子和粘附分子等的合成，最終形成“級聯(lián)效應”，放大炎癥反應，最終導致劇烈的炎癥反應 (Coccoetal., 2014)。我們的實驗觀察到SWA可以降低LX-2細胞的活力，增加細胞LDH的釋放和活化的Caspase-1的表達，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴效應。初步表明，SWA可以誘發(fā)肝星狀細胞的細胞焦亡。提示我們SWA對血吸蟲感染過程中局部炎癥微環(huán)境的形成有著重要的作用。

對于NLRP3炎癥小體的激活機制目前主要有3種模型：溶酶體活性；離子通量，尤其是鉀離子流出和活性氧(ROS)。ROS是NLRP3炎性體激活中常見的上游刺激信號 (Amer, 2011; Latz, 2010)。已有報道發(fā)現(xiàn)使用ROS抑制劑阻斷，可以減少NLRP3炎癥小體的活化和纖維化(Leptaketal., 1997; Wuetal., 2018)。我們的實驗發(fā)現(xiàn)，SWA可以引起LX-2細胞中ROS的生成。為了進一步說明ROS參與了SWA誘導的LX-2細胞NLRP3炎癥小體活化的過程，我們使用了NAC抑制了細胞ROS的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)SWA誘導的LX-2細胞內(nèi)NLRP3炎癥小體的形成、Caspase-1的活化和IL-1β的分泌被顯著抑制，同時α-SMA和ColⅠ表達也顯著下調(diào)。這提示我們，LX-2細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生可能是SWA誘導NLRP3炎癥小體活化和纖維化的關鍵因素。

綜上所述，本研究表明，SWA可以激活LX-2細胞內(nèi)NLRP3炎癥小體的活化，并誘導炎癥因子和纖維化相關基因的表達。并且，SWA刺激可以誘導細胞內(nèi)ROS反應，介導NLRP3炎癥小體激活。提示我們，SWA誘導的LX-2細胞內(nèi)NLRP3炎癥小體的激活可能是血吸蟲感染早期局部炎癥和纖維化形成的關鍵機制之一。