蠶沙中果膠的提取工藝及其抗氧化活性研究

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(1. 安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽合肥 230088；2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽合肥 230036； 3. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院；安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，安徽合肥 230012)

0 引 言

蠶沙，別名蠶矢，是蠶蛾科家蠶屬昆蟲家蠶幼蟲的干燥糞便，是一種傳統(tǒng)的中藥材[1]，其入藥歷史悠久，始載于《名醫(yī)別錄》中，《本草綱目》記載：“治消渴，癥結(jié)，及婦人血崩，頭風(fēng)，風(fēng)赤眼，去風(fēng)除濕?！毙Q沙性味辛、溫，歸肝、脾經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕、和胃化濁、活血通絡(luò)等功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蠶沙具有降血脂、抗腫瘤、降血糖、抗氧化、抑菌、消炎、抗病毒等活性。原因在于蠶沙中含有多種化學(xué)成分，如：葉綠素、果膠、葉酸、生物堿等[7]。其中，蠶沙果膠在防治冠心病、動(dòng)脈硬化、高血脂等心血管疾病方面的作用越來越引起人們的重視[8]，然而關(guān)于蠶沙中提取的果膠進(jìn)行抗氧化研究較少，因此，實(shí)驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化蠶沙果膠的提取工藝，通過化學(xué)抗氧化法對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為其進(jìn)一步研究開發(fā)和應(yīng)用，拓展其在食品工業(yè)的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1)儀器：紫外可見分光光度計(jì)TU-1810：北京普析通用儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9101-3A：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；電子天平FA2004：上海越平科學(xué)儀器有限公司。

2)試劑：蠶沙：購自于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)安徽新華學(xué)院生藥學(xué)教師許燕老師鑒定合格，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 蠶沙中果膠的含量測(cè)定及提取工藝確定

2.1.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液制備：

精密稱取20 mg干燥至恒重的無水葡萄糖對(duì)照品，置于100 mL的容量瓶中，先加適量水完全溶解后，繼續(xù)加水定容至相應(yīng)刻度，搖勻，即得濃度為0.2 mg/mL葡萄糖對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

2.1.2 樣品溶液配制：

取20 g風(fēng)干的蠶沙，加少量水浸泡后除去其中的泥沙等雜質(zhì)，加入200 mL水，加熱煮至微沸滅酶，3 min，按一定的料液比例加入配置好的0.6 %稀硫酸溶液，溫度控制在70 ℃，回流冷凝提取，抽濾后濃縮，加乙醇溶液，靜置24 h，抽濾得到果膠固體，70 ℃下干燥至恒重。精密稱取果膠成品10 mg，置于100 mL容量瓶中，加適量水溶解后，定容至相應(yīng)刻度，搖勻后，即得蠶沙果膠樣品溶液[9]。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：

精確吸取葡萄糖對(duì)照品溶液2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL，置于100 mL容量瓶中，加水定容至相應(yīng)刻度后，搖勻，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取2.0mL系列標(biāo)準(zhǔn)液置于不同試管中，量取蒸餾水2.0 mL作為空白對(duì)照，分別加入1 mL已配制的5 %苯酚溶液，搖勻后迅速加入5 mL濃硫酸，立即搖勻，于40 ℃水浴中保溫，30 min后取出，放于冷水浴中5 min，使其降至室溫。以2.0 mL蒸餾水所得空白溶液作為參比，490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，以吸光度(A)對(duì)濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程為：A= 0.024C+ 0.041 (r2=0.9966)。結(jié)果表明，葡萄糖在4.0-20.0 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.4 方法學(xué)考察:

取線性范圍內(nèi)的濃度，按“2.1.3”項(xiàng)下處理，分別對(duì)精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率進(jìn)行考察，結(jié)果顯示樣品的穩(wěn)定性良好，RSD(%)<5 %，加樣回收率>95 %，表明本實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定可靠。

2.1.5 正交試驗(yàn)[10]：

在前期預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以提取次數(shù)A、提取時(shí)間B、料液比C為影響因素確定正交試驗(yàn)方案，以浸出物和多糖提取量的綜合評(píng)分為指標(biāo)，設(shè)定綜合評(píng)分總分為10分，浸出物提取量和多糖提取量的權(quán)重系數(shù)均為5，因素與水平見表 1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表 2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

圖1 VC和蠶沙果膠還原力的比較

F0. 05(2,2) = 19.00;F0.01(2,2)=99.00

由表2和表3得出，蠶沙果膠提取量影響因素大小為A>B>C，即提取次數(shù)>提取時(shí)間>料液比，故最佳提取工藝為A2B3C2，即提取次數(shù)為2次 ，提取時(shí)間為100 min，料液比為1∶20。

表3 方差分析表

2.1.6 驗(yàn)證試驗(yàn)：

按最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，得平均浸出物和多糖的提取量分別為108.59 mg/g和111.24 mg/g。

2.2 蠶沙果膠抗氧化活性研究[11]

2.2.1 抗氧化活性的測(cè)定

2.2.1.1 還原能力測(cè)定：

按照“2.1.2”項(xiàng)下最優(yōu)提取工藝制備的蠶沙果膠固體配制成不同濃度溶液各1 mL、0.2 mol/L PBS(pH=6.6)2.5 mL、1 %的K3Fe(CN)6溶液2.5 mL分別加入到同等規(guī)格的試管中，混合搖勻后在50 ℃的水浴中保溫，20 min后，迅速冷卻至室溫，移取2.5 mL的10 %三氯乙酸溶液加入試管中，混勻，3000 r/min離心10 min，取上層清液2.5 mL，加入2.5 mL的蒸餾水和0.5 mL的0.1 %三氯化鐵溶液，充分搖勻后，靜置10 min，以蒸餾水作為空白對(duì)照，于700 nm處測(cè)待測(cè)品的吸光度值，見圖1。

圖1表示不同濃度蠶沙果膠的還原力，可以看出隨著濃度的增高，蠶沙果膠的還原力不斷增高，在低于0.06 mg/mL時(shí)，還原力略優(yōu)于VC，但當(dāng)大于0.06 mg/mL時(shí)VC的還原力優(yōu)于蠶沙果膠。

2.2.1.2 ·OH清除能力的測(cè)定：

按照“2.1.2”項(xiàng)下最優(yōu)工藝制備得到的蠶沙果膠固體配制成不同濃度溶液各1 mL、1.8 mmol/L硫酸亞鐵溶液2 mL、1.8 mmol/L水楊酸-乙醇1.5 mL分別加入到同等規(guī)格的試管中，0.1 mL的0.03 %H2O2溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，搖勻后，37 ℃水浴鍋中保溫，30 min后，以蒸餾水為對(duì)照品，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，平行測(cè)定3次，見表4。

表4 蠶沙果膠清除自由基的能力

計(jì)算公式(1)：

清除率%=(A對(duì)照-A樣品)×100%/A對(duì)照

(1)

3 結(jié) 論

蠶沙果膠的最佳提取工藝為A2B3C2，即提取次數(shù)為2次 ，提取時(shí)間為100 min，料液比為1∶20。同時(shí)蠶沙果膠有一定的還原能力，對(duì)羥基自由基的EC50為195.17 μg/mL。

由于蠶沙資源豐富，成本較低，具有一定的抗氧化能力，后期可以進(jìn)一步開展動(dòng)物試驗(yàn)的體內(nèi)研究，為后期開發(fā)蠶沙綜合利用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。