多花黃精種子后熟過程生理研究

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(1.西南中藥材種質創(chuàng)新與利用國家地方聯(lián)合工程研究中心， 云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院， 昆明 650201； 3.金平慧達農(nóng)林開發(fā)有限公司， 云南 紅河 661500)

多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua.)為百合科黃精屬多年生草本植物，藥用歷史有兩千多年，俗稱姜形黃精，同時還具有食用性。李時珍曰:“黃精為服食要藥”,體現(xiàn)其藥食兩用性[1]。多花黃精以黃精多糖、甾體皂苷為主要有效成分[2]，具有補氣養(yǎng)陰、益腎填精、生津補脾等功效[3-5]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，黃精有降血糖、血脂、血壓和抗衰老的作用，對治療心血管疾病、糖尿病等方面也有較好效果[6-7]。中國該屬植物有30多種。多花黃精主產(chǎn)于四川、湖南、云南等省，是中國的特有植物。

種子休眠是植物種子對外界環(huán)境的一種適應機制[8]，很多學者對種子休眠原因及打破種子休眠的方法進行了大量的研究[9-16]。發(fā)現(xiàn)種子休眠的類型及原因包括兩大類:第一類是胚本身的因素導致的。包括胚發(fā)育未完成；生理上沒成熟；缺少必須的激素或者抑制種子萌發(fā)物質的存在。種子需要通過后熟過程，完成一系列生理生化變化后才能萌發(fā)。第二類是外源因素導致的，即胚以外的各種組織導致休眠，比如種殼產(chǎn)生的機械阻礙或存在抑制物，種子不透水、不透氣等[17-20]。

黃精種子具有休眠現(xiàn)象，研究表明黃精種子休眠屬于胚本身原因引起的休眠，即種胚有一個后熟期，也可能是種胚內(nèi)內(nèi)源激素GA和CK相對較少，種子處于休眠狀態(tài)，即使有適宜的環(huán)境條件種子仍不能萌發(fā)。導致黃精種子休眠的原因包括胚的后熟以及種子結構。

張躍進等研究表明黃精種子屬于綜合休眠。多花黃精與黃精同為黃精屬，其形態(tài)特征和內(nèi)環(huán)境等都具有相似性，因此都具有休眠性，發(fā)芽率較低。多花黃精單獨作為一個種，但關于多花黃精種子繁殖技術的報道較少。張旺凡[21]和趙致等[22]分別利用適宜濃度的外源6-BA和GA3處理和低溫貯藏的方法來打破多花黃精種子休眠，都得到較好的發(fā)芽效果。劉保才將多花黃精種子在不同條件下貯藏，發(fā)現(xiàn)在低溫和常溫下層積種子打破休眠效果較好[23]。周建金等為打破黃精種子休眠、提高種子發(fā)芽率，利用組織培養(yǎng)技術，對多花黃精種子進行不同濃度GA3處理和不同時間的低溫貯藏處理[24]。張旺凡認為，多花黃精種子休眠屬于胚本身原因引起的休眠，即種胚有一個后熟期[21]。

多花黃精種子具有休眠性，發(fā)芽率低，使得多花黃精資源開發(fā)利用、人工育種栽培遇到困難。所以本研究探討了層積后熟過程中多花黃精種子生理生化的變化，通過測定多花黃精種子后熟過程中內(nèi)源激素及關鍵酶活性的變化,明確胚發(fā)育與內(nèi)源激素及呼吸途徑關鍵酶的動態(tài)變化規(guī)律,為實際生產(chǎn)中采用生化手段調(diào)控胚休眠,及促進后熟提供理論指導，完善多花黃精種子休眠機制理論。同時為多花黃精種苗育種及資源更合理的利用提供便利。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

種子采自云南省金平縣大老塘種植基地的二年生多花黃精植株，經(jīng)鑒定為百合科植物多花黃精的果實和種子。采收果實后密封1周揉搓去掉果皮，洗凈獲得多花黃精種子，用濾紙吸干外表水分備用。實驗在西南生物多樣性實驗室進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 多花黃精種子后熟期間生理生化指標測定

以干燥貯藏的種子(袋裝自然存放)為對照，將種子按20 ℃層積、20 ℃與4 ℃(每24 h交替1次)交替層積、4 ℃層積、-20 ℃層積4種方法處理(將種子與濕砂按體積1∶5層積，河砂濕度手捏剛出水而不落，定期噴水保濕)。以后每10 d測定不同貯藏條件下多花黃精種子后熟期間的下列各項指標，各項測定均重復3次。

種子激素測定方法：脫落酸含量、赤霉素含量、細胞分裂素含量、生長素含量采用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒測定。

1.2.2 多花黃精種子發(fā)芽實驗

以干燥貯藏種子為對照，將種子按20 ℃層積、20 ℃與4 ℃(每24 h交替1次)交替層積、4 ℃層積、-20 ℃層積4種方法處理，貯藏70 d后進行種子萌發(fā)實驗。

萌發(fā)前，種子先于20 ℃培養(yǎng)箱清水浸泡24 h，再播種于內(nèi)徑為15 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，內(nèi)放3層濾紙，蒸餾水培養(yǎng)， 25 ℃黑暗條件下智能人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每處理均重復3次，每重復50粒種子。以種胚突破種皮為標準，間隔20 d統(tǒng)計1次發(fā)芽數(shù)，共統(tǒng)計3次。

2 結果與分析

2.1 不同貯藏條件下種子萌發(fā)情況

多花黃精種子具有休眠特性，需要經(jīng)過一段時間的層積處理完成后熟才能萌發(fā)。作為對照，在干燥貯藏條件下，多花黃精種子層積50 d后生活力完全喪失，種子失去發(fā)芽力。與對照相比，層積70 d后，4 ℃層積、交替層積和20 ℃層積這3種貯藏條件下多花黃精種子的生活力分別為72.33%、70.67%和 70.67%，將不同貯藏條件下的種子分別置于25 ℃黑暗條件并給予一定水分之后，20 d后種子陸續(xù)開始萌發(fā)，萌發(fā)率分別為62%、59%和55%，4 ℃條件下萌發(fā)率最高；而-20 ℃貯藏條件下的種子，層積70 d后，種子生活力降為0，將種子置于25 ℃并給予一定水分之后，未能萌發(fā)。

表1 不同貯藏條件下種子生活力和發(fā)芽率

貯藏條件生活力(層積70d后)(%)發(fā)芽率(%)干燥貯藏0020℃層積70.6755交替層積70.67594℃層積72.3362-20℃層積00

2.2 不同貯藏條件下種子內(nèi)源激素含量的變化

GA更多的被認為是促進種子解除休眠的必要因子，GA主要通過2種途徑來促進種子解除休眠: 1) 動員種子內(nèi)的貯藏物質,刺激胚的生長; 2) 増強軟化屏障組織水解酶的表達,降低根尖的機械阻力,促進胚根突破種皮。

在多花黃精后熟過程中,4 ℃、交替和20 ℃ 3種層積方式的GA3含量都隨時間的推移表現(xiàn)為先降低后升高(如圖1)，其中4 ℃層積和20 ℃層積條件下種子在30 d時降為后熟過程中最低，分別為0.523 pmol/g和0.614 pmol/g；交替條件種子在40 d時達最低值(為0.621 pmol/g)。如圖1表明，層積處理對赤霉素無顯著影響。

圖1 不同貯藏條件下多花黃精種子后熟期間赤霉素含量的變化

在種子后熟過程中(如圖2)， 隨著貯藏時間延長，4 ℃條件下的IAA含量隨時間的推移表現(xiàn)為先降低后升高再降低的趨勢，在30 d和40 d分別達到整個后熟過程中的最低值和最高值，分別為0.141μmol/g和0.201μmol/g,后持續(xù)下降直到層積結束；20 ℃條件下，種子在前40 d 有小幅度的升降，為0.18μmol/g，在50～70 d開始下降,70 d時為0.165μmol/g；交替條件下，在10 d時IAA含量由最初的0.175μmol/g降低為0.154μmol/g，在20 d時上升后再下降，在40 d時達到后熟過程中的最低值0.123μmol/g，后有小幅升高直至層積結束，為0.131μmol/g。4 ℃條件下的波動顯著可能說明4 ℃條件下IAA參與了種子后熟某些機制的調(diào)控，或者是對ABA的抑制并且反應活躍。

在種子后熟過程中(如圖3)，在20 ℃層積的貯藏條件下，層積20 d后CTK含量從191.21 ng/g 上升為267.00 ng/g，30 d快速下降為188.36 ng/g，隨著時間小幅變化，70 d時上升為288.03 ng/g；在20 ℃層積、4 ℃層積這2種貯藏條件下，種子的CTK含量變化趨勢基本一致，均隨著層積時間的延長而表現(xiàn)出先降低后升高再降低的趨勢，不同的是，不同貯藏條件下種子CTK含量在整個層積過程中達到峰值的時間先后略有差異，在4 ℃條件下，CTK含量出現(xiàn)2個峰值，層積30 d后達到第1個峰值，為293.73 ng/g，之后逐漸下降，層積50 d后有小幅回升，到層積60 d時達到第2個峰值，為301.32 ng/g，之后逐漸下降直到層積結束；在20 ℃條件下，2個雙峰出現(xiàn)在20 d和40 d，分別為267.00 ng/g和285.13 ng/g，隨后又開始下降再升高，到70 d層積結束時為 288.03 ng/g。

圖2 不同貯藏條件下多花黃精種子后熟期間生長素含量的變化

圖3 不同貯藏條件下多花黃精種子后熟期間細胞分裂素含量的變化

圖4 不同貯藏條件下多花黃精種子后熟期間脫落酸含量的變化

在種子后熟過程中(如圖4)，在3種不同貯藏條件下，ABA含量差異明顯。在4 ℃層積貯藏條件下，層積10 d后ABA含量從651.23 ng/g 下降為345.74 ng/g，隨著時間小幅變化，40 d時上升為469.82 ng/g，隨后下降再上升，層積結束時為417.20 ng/g；在20 ℃層積貯藏條件下，種子的ABA含量隨著層積時間的延長而表現(xiàn)出先小幅度升高后下降再升高，50 d時為后熟過程中最小值，為703.85 ng/g，層積結束時為714.06 ng/g；在交替層積貯藏條件下，隨著層積時間的延長而表現(xiàn)出先小幅度降低后在50 d快速升高，在60 d達到最大值，為795.73 ng/g，后下降，層積結束時為714.06 ng/g。

3 討 論

多花黃精種子具有胚后熟的習性，發(fā)芽率低，對多花黃精種子育苗與育種工作的開展造成阻礙，但目前有關多花黃精種胚后熟的機制方面的研究較少。通過對多花黃精種胚后熟過程中ABA、GA3、IAA和CTK等幾種主要內(nèi)源激素含量的變化規(guī)律研究，探索縮短或延長種胚發(fā)育時期的方法和途徑，為種胚后熟機理的深入研究和生產(chǎn)中的種苗繁殖提供依據(jù)。

3.1 GA3, IAA對多花黃精種子后熟的調(diào)控作用不明顯

在多數(shù)休眠種子中，GA3含量和ABA含量之間的平衡關系是種子破除休眠的關鍵條件。但是在本實驗的多花黃精種子層積過程中，種子內(nèi)檢測到的GA3和IAA含量都非常低,且變化不明顯，可以推測多花黃精種子休眠解除與GA3和IAA水平的變化關系不大。GA3在整個層積過程含量較低，變化不明顯，一直維持在0.5～1.0 pmol/g之間，凡是能夠正常發(fā)芽的種子均存在具有生理活性的赤霉素，但是存在生理活性的種子不一定能發(fā)芽[25]，仍需要滿足其他利于種子發(fā)芽的生理條件，說明赤霉素可能不是打破多花黃精種子休眠主要因素，這與史靜等[26]的研究結果類似。另一方面，考慮到GA3和IAA難提取和易分解的特性，故不能排除在本實驗中GA3和IAA因提取和保藏方法不當，可能造成檢查結果存在偏差。

3.2 ABA、CTK可能參與了多花黃精種子的后熟生理調(diào)控

多花黃精種子在層積處理0～70 d中，在4 ℃貯藏條件下，CTK的含量表現(xiàn)出先升高后下降再升高再下降的趨勢，出現(xiàn)了2個峰值，分別為第30天和第60天，含量分別為293.73 ng/g和301.32 ng/g，而ABA含量在貯藏30 d和60 d時為后熟過程中的2個谷底值，可以發(fā)現(xiàn)CTK和ABA含量的變化趨勢相反，說明這2種激素在調(diào)控著種子的休眠與萌發(fā)；同樣在20 ℃層積和交替層積貯藏條件下，在第60天，種子CTK含量出現(xiàn)迅速下降的同時發(fā)現(xiàn)ABA的含量出現(xiàn)上升的情況，再次說明CTK和ABA這2種激素在互相影響，調(diào)控著種子的休眠與萌發(fā)。故推測CTK和ABA可能參與了多花黃精種子胚后熟生理調(diào)控。在肉蓯蓉種子層積處理破除休眠的研究[27-28]中也曾發(fā)現(xiàn)細胞分裂素含量的顯著升高，并指出細胞分裂素促進種子萌發(fā)相關酶活性的增強，還可能對拮抗種子內(nèi)含萌發(fā)抑制物有利。試驗還發(fā)現(xiàn)，在層積過程中，與其它2種貯藏條件相比，4 ℃貯藏條件下的ABA的含量最低，CTK含量也相對較高，可能表示4 ℃條件下進行層積處理更適于多花黃精種子打破休眠，這與種子萌發(fā)試驗中4 ℃貯藏條件下種子萌發(fā)率最高的結果相一致。

3.3 多花黃精種子在胚后熟過程中的關鍵期

在20～40 d期間，多花黃精種子激素CTK/ABA含量的比值在整個層積過程中表現(xiàn)出升高的現(xiàn)象，有利于種子萌發(fā)。因此可以認為，在整個層積處理過程中，20～40 d是多花黃精種子打破休眠的一個關鍵期。

4 結 論

本研究通過對不同貯藏條件下多花黃精種子植物激素含量及種子成活率的動態(tài)測定，結果表明：

多花黃精種子層積第20～40天是胚后熟的關鍵期，種子代謝最為活躍。

4 ℃層積貯藏最有利于多花黃精種子萌發(fā)，發(fā)芽率達72.33%。超低溫條件貯藏不利于種子生活力的保持。