狂犬病毒PV-2061株免疫熒光檢測(cè)方法的可行性

李爽 田威 (通訊作者) 謝花 李鶴

（沈陽(yáng)藥科大學(xué) 遼寧 沈陽(yáng) 110016）

狂犬病是一種人獸共患急性傳染病，由狂犬病毒引起的，可導(dǎo)致嚴(yán)重的中樞系統(tǒng)疾病，又稱恐水癥，是死亡率高達(dá)100%的急性傳染病，被傳染病防治法列為乙類傳染病?？袢≈两袢詿o(wú)特效的治療方法，實(shí)施疫苗免疫是預(yù)防和控制狂犬病發(fā)病最有效的措施[1]。為保證狂犬疫苗免疫的有效性，開展對(duì)RV毒力的檢測(cè)十分必要。本文旨在建立簡(jiǎn)單、快速、特異性好、敏感度高的免疫熒光的檢測(cè)方法，對(duì)狂犬病毒PV-2061株進(jìn)行檢測(cè)。

1.材料和方法

1.1 主要材料

狂犬病毒PV-2061株：原始毒株來(lái)源于ATCC；Vero細(xì)胞：來(lái)源于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。FITC標(biāo)記的抗狂犬病病毒特異性熒光抗體：購(gòu)自美國(guó)Novus公司，濃度0.75mg/ml。

1.2 熒光抗體最佳工作濃度的確定

1.2.1 熒光抗體稀釋：用PBS將熒光抗體2倍系列稀釋，取50×、100×、200×、400×、800×、1600×共6個(gè)稀釋度。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：將Vero細(xì)胞稀釋成1×105個(gè)/ml，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100μl/孔，放二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 加毒：取一批狂犬病毒樣品，稀釋成濃度為1×10-3。加入到已制備好的單層96孔板中，100μl/孔，放培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h。

1.2.4 固定：取出96孔板，棄培養(yǎng)基，PBS洗板3次，加冷丙酮，-4℃固定30分鐘。棄丙酮，風(fēng)干。

1.2.5 加熒光抗體：加入2倍倍比稀釋的熒光抗體，每個(gè)稀釋度加一列8孔，50μl/孔。37℃濕育1h，PBS洗板3次，置熒光顯微鏡下觀察。記錄熒光病灶數(shù)，以出現(xiàn)“++++”的抗體最大稀釋濃度為其最佳工作濃度。

1.3 免疫熒光測(cè)定法

1.3.1 病毒稀釋：將16批狂犬病毒樣品10倍稀釋，取6個(gè)稀釋度（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8），接種到制備好的96孔板中，100μL/孔，每個(gè)稀釋度加每列6孔，剩余2孔加培養(yǎng)基作為空白對(duì)照孔，培養(yǎng)48h。

1.3.2 按1.2.4固定。

1.3.3 熒光染色：加入最佳工作濃度的熒光抗體，50μL/孔。37℃濕育1h，洗板，鏡下觀察。記錄熒光灶數(shù)，細(xì)胞漿內(nèi)有綠色熒光顆粒者為陽(yáng)性，正常細(xì)胞對(duì)照無(wú)特異性熒光為陰性，以Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度。

1.4 小鼠測(cè)定法

將16批病毒樣品10倍稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-7四個(gè)稀釋度，腦內(nèi)接種小鼠，6只/稀釋度，0.03ml/只。觀察14d，計(jì)算結(jié)果。

1.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

采用兩名實(shí)驗(yàn)人員在相同的條件下，分別用免疫熒光法和小鼠法檢測(cè)同一批病毒滴度，每人檢測(cè)3次，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)6次。

2.結(jié)果

2.1 免疫熒光抗體最佳工作濃度的確定，結(jié)果見(jiàn)表1

以熒光抗體清晰的顯示特異性熒光，且熒光閃亮，空白對(duì)照的非特異染色弱的最大稀釋比例為最佳工作濃度，本文選擇100倍為最終的熒光抗體稀釋倍數(shù)。

表1 熒光抗體工作濃度

2.2 病毒樣品的檢測(cè)結(jié)果

16批病毒液樣品用免疫熒光法及小鼠腦內(nèi)滴定法測(cè)定病毒滴度，結(jié)果見(jiàn)表2。兩種方法檢測(cè)的結(jié)果趨勢(shì)相同，見(jiàn)圖1。免疫熒光法與小鼠法進(jìn)行比較，顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值為0.187，P＞0.05），相關(guān)系數(shù)為0.629，說(shuō)明兩種方法呈良好的正相關(guān)性。

表2 16批狂犬病毒滴度的結(jié)果

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，同一份病毒樣本分別用免疫熒光法和小鼠法檢測(cè)6次，結(jié)果見(jiàn)表3。免疫熒光法測(cè)得的結(jié)果平均值為6.81，數(shù)據(jù)與平均值的最大差值為0.19，變異系數(shù)為1.69%；小鼠法測(cè)得的結(jié)果平均值為6.95，數(shù)據(jù)與平均值最大差值為0.43，變異系數(shù)為3.31%，因此說(shuō)明免疫熒光法有更好的重復(fù)性，精密度更高。

圖1 16批病毒樣品的滴度結(jié)果

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)兩種方法測(cè)得的病毒滴度

3.討論

近年來(lái)隨著科技的發(fā)展，針對(duì)病毒滴度的生物學(xué)檢測(cè)方法

越來(lái)越先進(jìn)，但也有優(yōu)勢(shì)和局限性。小鼠法是《中華人民共和國(guó)藥典》三部（2015版）[2]規(guī)定狂犬病毒的經(jīng)典檢測(cè)方法，但因其檢測(cè)周期較長(zhǎng)，動(dòng)物個(gè)體差異影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果等缺點(diǎn)，被細(xì)胞法取代是必然趨勢(shì)。免疫熒光法是將熒光色素標(biāo)記技術(shù)的靈敏性，再加上抗原抗體反應(yīng)的特異性，兩者結(jié)合的一種免疫檢測(cè)技術(shù)。另外該法可精確計(jì)數(shù)被病毒感染的細(xì)胞個(gè)數(shù)，因此敏感性也很好。目前，國(guó)內(nèi)也已經(jīng)開始采用免疫熒光法控制狂犬病疫苗的生產(chǎn)過(guò)程[3]。本文采用兩種方法檢測(cè)狂犬病毒毒力，趨勢(shì)相同，相比之下變異系數(shù)更小，且重復(fù)性和精密度更好。因此，免疫熒光法作為狂犬病毒滴度的定量測(cè)定是可行的，值得推廣。