銀納米粒子的SERS效應(yīng)和SEF效應(yīng)在微流控芯片光學(xué)檢測中的應(yīng)用

郭 威， 吳 堅(jiān)*， 王春艷， 陳 濤

( 1. 北京工業(yè)大學(xué) 激光工程研究院， 北京 100124；2. 中國航天員科學(xué)研究訓(xùn)練中心 航天醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100094)

1 引 言

作為多學(xué)科交叉前沿技術(shù)，微流控芯片技術(shù)可以用來檢測無機(jī)離子、有機(jī)物質(zhì)、生化組分等，具有自動化程度高、試劑用量少、污染少的優(yōu)點(diǎn)。目前微流控的研究主要集中在生物學(xué)應(yīng)用上，但其在化學(xué)、流體物理、新材料等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。微流控芯片技術(shù)主要包括微流控芯片制作、微流體驅(qū)動、溫度控制、熒光檢測等，其中微流控芯片的檢測方法是微流控技術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)之一，目前應(yīng)用較為廣泛的是光學(xué)檢測方法。在微流控芯片微通道中檢測到的熒光由于樣品量小造成激發(fā)出的熒光十分微弱，這使得光學(xué)檢測變得十分困難。表面增強(qiáng)拉曼(Surface enhanced Raman scattering,SERS)作為獨(dú)特的檢測技術(shù)被引入到微流控芯片的光學(xué)檢測中，且在近十年得到快速發(fā)展。SERS效應(yīng)是指當(dāng)分子被吸附在金屬表面或溶液中時，樣品表面或近表面的電磁場增強(qiáng)使得其拉曼散射信號強(qiáng)度得到極大增強(qiáng)。這種技術(shù)由Fleishmann等于1974年首次發(fā)現(xiàn)[1]，該技術(shù)現(xiàn)已逐漸成為單分子測量的重要手段[2-4]。SEF效應(yīng)原理與SERS相似，由于金屬納米粒子的表面等離子體共振特性，周圍電磁場的強(qiáng)度得到極大增加，進(jìn)而影響吸附于其表面及附近熒光物的發(fā)光特性，最終使得熒光強(qiáng)度得到成倍的提高。在Lakowicz團(tuán)隊(duì)對SEF現(xiàn)象進(jìn)行了大量研究并完善了SEF理論模型后[5]，SEF逐漸得到了研究人員的重視，被應(yīng)用在生物傳感和光譜檢測研究中。Novotny等的研究工作證明表面增強(qiáng)熒光強(qiáng)度會隨分子-金屬表面間距的變化而發(fā)生改變[6]。單體水平的研究在許多方面正逐漸成為研究微納光子學(xué)問題的獨(dú)特方式[7-8]，但是其熒光增強(qiáng)最高只有8倍左右。Kinkhabwala等[9]首次實(shí)驗(yàn)報(bào)道了3個數(shù)量級以上的熒光增強(qiáng)效果。最近，法國Wenger教授研究組[10]提出了一種二聚體內(nèi)嵌于微孔的新型光學(xué)天線，該結(jié)構(gòu)的表面熒光增強(qiáng)達(dá)約1 100倍。國內(nèi)也有文獻(xiàn)報(bào)道了SEF的特性研究，劉麗雙等研究了Ag 納米顆粒的質(zhì)量濃度對拉曼與熒光光譜強(qiáng)度的影響[11]，徐良敏等研究了金屬表面熒光增強(qiáng)的物理增強(qiáng)機(jī)制[12]，董軍等研究了拋光金屬銀表面的羅丹明6G熒光增強(qiáng)效應(yīng)[13]。多種特定尺寸的金屬納米粒子都可以產(chǎn)生SERS效應(yīng)和SEF效應(yīng)，其中金納米粒子和銀納米粒子應(yīng)用較為廣泛。

為了改善微流控芯片光學(xué)檢測中遇到的熒光信號微弱問題，我們提出使用一種在微通道中增加銀納米粒子、利用其產(chǎn)生的SERS效應(yīng)和SEF效應(yīng)實(shí)現(xiàn)改善熒光素SYBR GreenⅠ混合液檢測結(jié)果的方法，SYBR GreenⅠ是一種可被475 nm的光所激發(fā)的熒光染料，激發(fā)后結(jié)合雙鏈DNA的SYBR GreenⅠ會發(fā)射530 nm左右的熒光，這種特性使得其可被應(yīng)用在生物檢測中。我們通過在微流控芯片微通道中添加銀納米粒子后實(shí)現(xiàn)SYBR GreenⅠ混合液SERS和SEF信號的增強(qiáng)，并分別對SERS增強(qiáng)效果和SEF增強(qiáng)效果進(jìn)行了檢驗(yàn)和分析。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)基板上的微流體芯片的制造

首先將PMMA切成片，用超聲波清洗器在去離子水中清洗，隨后在加壓空氣流下干燥。微流控芯片的微通道加工使用準(zhǔn)分子激光直寫系統(tǒng)對片狀PMMA進(jìn)行直寫刻蝕，準(zhǔn)分子激光器工作氣體為 KrF，波長為248 nm，入射能量為8 J/cm2，加工方式為冷加工。光束平移速度為10 mm/min，同時，利用0.3 MPa的壓縮空氣在刻蝕的同時清潔PMMA基板的表面，以避免灰塵的形成。制造裝置如圖1所示，制作出的微流控芯片微通道寬度約為200 μm，深度約為68 μm。

圖1 微流體芯片制作示意圖

2.2 銀前體溶液及SERS與SEF基板的制備

在室溫下將1 g劑量的乙酸銀混合到2.5 mL氫氧化銨水溶液中，靜置15 s，然后將甲酸(0.2 mL)逐滴滴入溶液中。將溶液放于桌上靜置12 h，使大顆粒充分沉降，使用200 nm針筒式過濾器過濾。

使用微量注射器抽取前體溶液，將溶液滴入微通道的微小區(qū)域，然后將微流體芯片放在設(shè)置有不同溫度的加熱平臺上。加熱15 min后，產(chǎn)生銀納米顆粒并吸附在微流體芯片的通道中。使用去離子水沖洗掉過量的銀納米顆粒，獲得基于SERS與SEF的微流體系統(tǒng)，用于檢測SYBR GreenⅠ熒光染料。

有研究已經(jīng)證明納米粒子的大小和形狀會對表面等離子體共振特性產(chǎn)生重要影響，進(jìn)而影響表面增強(qiáng)拉曼的增強(qiáng)效率，當(dāng)粒子的尺寸小于入射光的波長、同時大于電子平均自由程時可以得到較好的增強(qiáng)效果，粒子的最佳尺寸為10～100 nm[14-15]。為此我們準(zhǔn)備不同尺寸的納米粒子進(jìn)行試驗(yàn)。銀納米粒子的制備主要分為兩個過程：成核階段和生長階段。決定納米晶形狀的關(guān)鍵因素之一就是成核階段中的反應(yīng)環(huán)境，特別是反應(yīng)溫度，控制反應(yīng)初始階段的溫度是至關(guān)重要的，直接影響著晶體的生長情況。為了獲得不同大小的銀納米粒子，我們分別在4種不同的溫度下(90，80，70，60 ℃)進(jìn)行基板的制備實(shí)驗(yàn)。

圖2為SERS與SEF基板的制備示意圖，加熱平臺溫度在4次制作過程中分別控制在90，80，70，60 ℃；圖3為制作的實(shí)物局部圖片，實(shí)際制作的基板大小為40 mm×65 mm×1 mm。

圖2 SERS與SEF基板的制備示意圖

圖3 基板實(shí)物局部照片

3 結(jié)果與討論

圖4顯示了不同溫度下在微流體通道中獲得的銀納米粒子的掃描電鏡圖像。在圖4(a)中，當(dāng)溫度為90 ℃時，制備的銀顆粒的粒徑約為1 μm。通過圖4可以看出納米粒子尺寸隨溫度的降低逐漸減小，當(dāng)溫度降到60 ℃時，納米顆粒的尺寸減小到幾十個納米(圖4(d))。

圖4 在不同溫度下的微流體中獲得的銀納米顆粒的SEM尺寸圖。(a)90 ℃；(b)80 ℃；(c)70 ℃；(d)60 ℃。

為了研究銀納米粒子(制備溫度為60 ℃)SERS和SEF效應(yīng)對SYBR GreenⅠ混合液的信號增強(qiáng)效果，我們使用激發(fā)波長為532 nm的拉曼設(shè)備(HR Evolution，HORIBA JOBIN YVON，法國)用于SERS 信號的檢測，使用自制的熒光檢測裝置(原理與Thermo Fisher公司的Qubit?3.0熒光計(jì)相同)對SEF信號進(jìn)行檢測。圖5為相同銀納米粒子濃度(2 mmol/L)下SYBR GreenⅠ混合液拉曼光譜和表面增強(qiáng)拉曼光譜測量結(jié)果，可以看出加入銀納米粒子后測量的信號與未加入銀納米粒子相比得到顯著增強(qiáng)。拉曼散射強(qiáng)度的增加由兩個方面的因素引起：一是吸附在銀納米粒子表面的SYBR GreenⅠ熒光分子之間的相互作用，二是粒子表面的等離子體共振作用。由于溶液中存在一定表面粗糙度的銀納米粒子，入射光產(chǎn)生的電磁場被明顯增強(qiáng)，而拉曼散射強(qiáng)度正比于分子所處光電場強(qiáng)度的平方值，使得吸附在銀納米顆粒表面的分子產(chǎn)生拉曼散射的幾率得到極大增加，最終表面拉曼強(qiáng)度檢測值得到了增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)中增強(qiáng)因子約為3.5×103。圖6顯示了相同銀納米粒子濃度(2 mmol/L)下SYBR Green Ⅰ 混合液的熒光光譜和表面增強(qiáng)熒光光譜對比結(jié)果，每組樣品測量5次，誤差范圍為5%，在可接受范圍內(nèi)。由圖6可看出熒光信號強(qiáng)度在添加銀納米粒子之后約增強(qiáng)了一倍。根據(jù)經(jīng)典電磁理論，電偶極子的方向和強(qiáng)度取決于兩個方面，一是激發(fā)光場的偏振方向和強(qiáng)度，二是入射光場方向的變化。在銀納米粒子的表面和熒光分子附近，等離子體振蕩電場的方向與激發(fā)場的方向是保持一致的，激發(fā)態(tài)熒光分子所激發(fā)的等離子體振蕩也增強(qiáng)了熒光分子周圍的激發(fā)態(tài)局部電場，最終使得熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

圖5 SYBR GreenⅠ的拉曼值和表面增強(qiáng)拉曼值

圖6 SYBR GreenⅠ的熒光值和表面增強(qiáng)熒光值

圖7顯示了在不同銀納米粒子稀釋濃度下SYBR GreenⅠ混合液的SERS增強(qiáng)結(jié)果，圖8顯示了不同銀納米粒子稀釋濃度下SYBR GreenⅠ混合液的SEF增強(qiáng)結(jié)果，可以看出，不同濃度銀納米粒子下的SYBR GreenⅠ混合液都可以獲得增強(qiáng)的信號，也說明本方法用在SYBR GreenⅠ的檢測時檢測結(jié)果可以得到可靠的提高，該方法在實(shí)時監(jiān)測聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中具有很大的潛力。

圖7 不同Ag納米粒子濃度SYBR GreenⅠ的SERS增強(qiáng)結(jié)果

圖8 不同Ag納米粒子濃度SYBR GreenⅠ的SEF增強(qiáng)結(jié)果

4 結(jié) 論

SYBR GreenⅠ是生物芯片檢測中常見的標(biāo)記物，研究SYBR GreenⅠ的檢測信號的增強(qiáng)，對提高微流控芯片中PCR熒光總量檢測靈敏度是非常有意義的。我們提出一種在微流控芯片微通道中添加一定尺寸的銀納米粒子來提高檢測結(jié)果的方法。在檢測SYBR GreenⅠ時通過增加銀納米粒子顯著增強(qiáng)拉曼和熒光信號，SERS實(shí)驗(yàn)的增強(qiáng)因子為3.5×103，添加銀納米粒子的樣品的熒光信號強(qiáng)度與不含銀納米粒子樣品的熒光信號強(qiáng)度相比，約增加了1倍，這種方法可以用于微流控芯片中SYBR GreenⅠ的SERS和SEF定量檢測。