孔雀草體內(nèi)低分子質(zhì)量巰基化合物對重金屬鎘的響應(yīng)

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(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 貴陽 550025)

隨著生活和工業(yè)廢棄物的長期排放、磷肥大量施用、礦產(chǎn)開采等人類活動導(dǎo)致環(huán)境中的鎘污染日趨嚴(yán)重。鎘由于其在水中溶解度大、毒性較高，并且在土壤污染中具有隱蔽性和滯后性等特點，因此是環(huán)境中最具危害性的重金屬之一[1-3]。研究表明，鎘對多種植物的代謝過程有毒性作用，例如光合作用、呼吸、氮代謝、蒸騰作用、養(yǎng)分吸收等[4-5]，越來越多的證據(jù)表明鎘會引起植物的氧化應(yīng)激反應(yīng)，改變膜的功能性，還會引起細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)損傷，高濃度鎘還會引起DNA損傷，干擾植物的生長和發(fā)育[6-9]，鎘還會通過食物鏈危害人類健康。因此，如何解決重金屬污染問題，將對人類健康和社會發(fā)展起著巨大的促進(jìn)作用。植物修復(fù)技術(shù)是一項新興的環(huán)境污染治理技術(shù)，將花卉植物應(yīng)用于重金屬污染土壤的修復(fù)，不僅能治理污染土壤，還能美化環(huán)境，產(chǎn)生一定的的經(jīng)濟效益[10]，這在污染土壤修復(fù)的實際應(yīng)用中已成為熱點研究內(nèi)容。

植物能以各種不同方式對重金屬毒性做出響應(yīng)，包括金屬離子固定、排出、螯合和區(qū)室化，以及更普遍的脅迫響應(yīng)機制如乙烯和應(yīng)激蛋白的表達(dá)等[5]。有研究表明，植物細(xì)胞內(nèi)含半胱氨酸殘基的巰基化合物與重金屬有較強的作用力[11]，其中半胱氨酸(Cys)是最重要的非蛋白巰基，他是合成谷胱甘肽的前體分子，在植物脅迫響應(yīng)中起重要作用，谷胱甘肽(GSH)是細(xì)胞中游離的、低分子量硫醇庫的主要組分，同時也是植物螯合肽(PCs)合成前體，主要以還原形式存在于細(xì)胞中，其大部分功能與谷胱甘肽的巰基及其作為還原劑有關(guān)，他在植株抗氧化過程中能被氧化成GSSG，高GSH/GSSG值是實現(xiàn)細(xì)胞中蛋白質(zhì)正確合成的必要條件[12-13]，植物螯合肽由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成，基本結(jié)構(gòu)(γ-Glu-Cys)n-Glu(n=2-11)，能與重金屬離子結(jié)合形成螯合物，這些復(fù)合物能被ABC-轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)移至液泡，達(dá)到解毒作用[14]。

孔雀草(TagetespatulaL.)是菊科萬壽菊屬一年生草本花卉，是鎘超富集植物，關(guān)于鎘脅迫對孔雀草低分子質(zhì)量巰基蛋白含量的影響卻未見報道。通過研究不同濃度鎘脅迫對孔雀草不同組織低分子質(zhì)量巰基蛋白含量的影響及相互關(guān)系，為進(jìn)一步研究孔雀草鎘脅迫耐受機制及對污染土壤的修復(fù)工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

孔雀草(TagetespatulaL.)種子采自貴州大學(xué)植物標(biāo)本園當(dāng)年結(jié)實的健壯植株，供試土壤為營養(yǎng)有機土，屬于清潔土壤，不含金屬物質(zhì)。

準(zhǔn)確稱取1.0 kg營養(yǎng)有機土裝入直徑為21 cm，高12 cm的盆中，將固體CdCl2·2.5 H2O投加到土壤中，配成所需鎘濃度為100，300，500 mg/kg的土壤，每日攪動，以使鎘在土壤中充分混合均勻。

選取健壯飽滿的孔雀草種子用75%乙醇消毒3 min。蒸餾水沖洗數(shù)次浸種12 h，播種10粒種子于不同濃度鎘污染盆中，每個處理4個重復(fù)，每個重復(fù)保苗4株，以蒸餾水處理作為對照組，種植約90 d后，分離根、莖、葉用于巰基化合物含量測定。

1.2 分析測定項目

測定部位：成熟期孔雀草根、莖、葉。

測定指標(biāo)：葉谷胱甘肽(GSH、GSSG)、半胱氨酸(Cys)、非蛋白巰基(NPT)。

試劑盒購于蘇州科銘。

采用差減法計算植物組織內(nèi)植物螯合肽(PCs)的含量，即PCs=NPT-GSH。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件和Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Cd處理下孔雀草根、莖、葉NPT含量的變化

不同處理下孔雀草根、莖、葉的NPT含量變化如圖1所示。由圖1可以看出，根、葉中NPT的含量隨著鎘濃度的增加呈先升高后下降的趨勢，莖中的NPT含量隨著鎘濃度增加而下降。隨著鎘濃度的升高，根中NPT含量比對照增加了13.25%(100 mg/kg)、15.06%(300 mg/kg)；葉中的NPT含量比對照增加了3.72%(100 mg/kg)、62.98%(300 mg/kg)、20.38%(500 mg/kg)，莖中的NPT含量比對照增加29.48%(100 mg/kg)、4.05%(300 mg/kg)，但高鎘(500 mg/kg)處理時降低了根和莖中NPT的含量。

圖1 不同濃度Cd處理對孔雀草根、莖、葉NPT含量的影響

2.2 不同濃度Cd處理下孔雀草根、莖、葉Cys含量的變化

不同處理下孔雀草根、莖、葉Cys含量變化如圖2所示，根中的Cys含量隨鎘濃度增加呈先降低后升高趨勢，在鎘濃度為100，300 mg/kg時比對照下降了11.94%、38.81%，在鎘濃度為500 mg/kg時比對照增加了35.82%；莖中的Cys含量隨鎘濃度增加呈先升高后降低趨勢，同對照相比，在鎘濃度為100 mg/kg時增加了102.50%，在鎘濃度為300，500 mg/kg時下降了65%、75.71%，葉中的Cys含量隨鎘濃度增加呈先降低后升高再降低趨勢，同對照相比，在鎘濃度為100，500 mg/kg時下降了32.32%、58.84%，在鎘濃度為300 mg/kg時增加了5.18% 。

圖2 不同濃度Cd處理對孔雀草根、莖、葉Cys含量的影響

2.3 不同濃度Cd處理下孔雀草根、莖、葉GSH、GSSG、GSH/GSSG含量的變化

不同處理下孔雀草根、莖、葉GSH含量變化如圖3 A所示，同對照相比，Cd增加了根中的GSH含量，其含量比對照增加1.54%(100 mg/kg)、17.90%(300 mg/kg)、50.93%(500 mg/kg)；低鎘(100 mg/kg)時增加了莖中的GSH含量，隨鎘濃度增加，GSH含量呈下降趨勢；葉中的GSH含量隨鎘濃度增加呈先下降后上升趨勢，其含量比對照降低12.81%、24.07%、21.60%。

圖3 B顯示：不同Cd處理使根中的GSSG顯著高于對照，在500 mg/kg 濃度時根中的GSSG含量比對照增加了49.67%，莖中的GSSG含量在低鎘(100 mg/kg)時比對照降低了50%，而高鎘(500 mg/kg)增加了莖中GSSG含量，葉中的GSSG含量隨鎘濃度增加呈先上升后下降趨勢，其含量比對照增加了19.72%(100 mg/kg)、32.39%(300 mg/kg)、在鎘濃度為500 mg/kg時比對照降低了11.27%。

圖3 C為Cd對根、莖、葉GSH/GSSG值的影響，根和葉中的GSH/GSSG值為100，300 mg/kg時比對照低，但在高鎘(300 mg/kg)時提高了根和葉GSH/GSSG值，低鎘(100 mg/kg)處理提高了莖中的GSH/GSSG值，在300，500 mg/kg時降低了莖中GSH/GSSG值。

圖3 不同濃度Cd處理對孔雀草根、莖、葉GSH、GSSG及GSH/GSSG含量的影響

2.4 不同濃度Cd處理下孔雀草根、莖、葉PCs含量的變化

不同處理下孔雀草根、莖、葉PCs含量變化如圖4所示，根、莖、葉中PCs含量隨鎘濃度升高呈先增加后降低趨勢，根比對照增加了14.41%(100 mg/kg)、14.78%(300 mg/kg)，莖比對照增加了33.72%(100 mg/kg)、6.67%(300 mg/kg)，葉比對照增加了7.44%(100 mg/kg)、82.60%(300 mg/kg)、29.84%(500 mg/kg)，在鎘濃度為500 mg/kg時，根、莖PCs含量比對照分別下降了5.02%、4.67%。

圖4 不同濃度Cd處理對孔雀草根、莖、葉PCs含量的影響

3 討 論

找到具有某種重金屬超積累特性的植株是植物修復(fù)的前提條件。目前，世界上大約有400多種、涵蓋20多個科的植物屬于重金屬超積累植物[15]。孔雀草是鎘超富集植物，觀察鎘脅迫下孔雀草生長狀況可知，即使在500 mg/kg鎘濃度脅迫下，孔雀草植株也未出現(xiàn)明顯毒害癥狀。巰基物質(zhì)在鎘的積累和運輸過程中起著重要作用，同時也是植物耐受重金屬脅迫及解毒的重要機制之一[16]。

由于鎘對-SH有很強的親和力，能夠誘導(dǎo)低分子質(zhì)量巰基化合物GSH、PC等與鎘形成Cd-GSH、Cd-PC復(fù)合體，減少胞質(zhì)中游離的鎘，并以Cd-SH形式運輸?shù)揭号葜羞M(jìn)行區(qū)隔化[17]。本實驗結(jié)果表明，Cd處理能夠誘導(dǎo)孔雀草根、莖、葉NPTs的產(chǎn)生，其中，葉中的NPTs含量隨介質(zhì)中鎘濃度增加而增加，低中劑量Cd誘導(dǎo)根莖中的NPTs含量增加，而高Cd降低了根莖中的NPTs含量。楊衛(wèi)東等研究表明，Cd處理強烈誘導(dǎo)旱柳(SalixmatsudanaKoidz.)根和葉NPTs產(chǎn)生，隨鎘濃度增加根和葉NPTs含量也隨之增加[18]；不同濃度Cd處理提高了印度芥菜(Brassicajuncea)葉片中NPTs含量[19]，馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)根和葉中NPTs含量隨Cd濃度和處理時間增加呈先上升后下降趨勢[20]。有研究表明，NPTs含量的增加促進(jìn)了Cys、GSH和PCs等低分子質(zhì)量巰基化合物的合成，這些物質(zhì)通過金屬硫醇鹽形式參與重金屬解毒和穩(wěn)態(tài)過程[21]。

Cys是硫酸鹽同化的初始產(chǎn)物，是谷胱甘肽合成的限速因子，Cys合成可能參與植物體對Cd的解毒過程[22]。本研究結(jié)果表明，不同Cd濃度對根Cys含量影響不大，高濃度Cd只是輕微增加根Cys含量，低濃度Cd促進(jìn)莖Cys合成，中高濃度Cd降低了莖Cys含量，葉中的Cys含量隨鎘濃度增加呈先下降后升高再下降趨勢。文獻(xiàn)報道，在擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.) Heynh.)葉子毛狀體中，增加半胱氨酸物質(zhì)含量可增強擬南芥對金屬的螯合能力[13]。當(dāng)印度芥菜超表達(dá)大腸桿菌(Escherichiacoli)編碼γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECS)的gsh1基因，與對照相比，γ-ECS轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出對Cd的耐受性增強并且具有更高濃度的PCs，γ-GluCys，谷胱甘肽和總非蛋白巰基含量[23]。

GSH能保護蛋白免受脅迫下蛋白質(zhì)巰基氧化引起的變性，他還是谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的底物，共同參與植物體活性氧(ROS)的去除[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨介質(zhì)中Cd濃度增加，根GSH、GSSG含量也隨之增加，低中Cd濃度誘導(dǎo)葉GSH含量下降，GSSG含量升高，高Cd濃度GSH含量升高而GSSG含量下降，不同濃度Cd對莖GSH、GSSG含量影響較小， 根中GSH/GSSG值較高，莖次之，葉最小。有文獻(xiàn)報道，Cd2+能引起美人蕉根GSH含量增加，并誘導(dǎo)PCs產(chǎn)生[25]，重金屬處理促進(jìn)秋茄(Kandeliacandel(Linn.) Druce)幼苗GSH合成，為PCs合成提供前提物質(zhì)[26]。GSH與其氧化形式GSSG一起，作為維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要氧化還原對，在植物不同信號系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[27]，但谷胱甘肽作為普遍的脅迫標(biāo)記物作用仍不清楚，因為谷胱甘肽反應(yīng)本身就處于動態(tài)平衡當(dāng)中。

PCs在植物對重金屬Cd的抗性機制中起重要作用，該物質(zhì)解毒作用與其重金屬結(jié)合能力有關(guān)，其結(jié)構(gòu)中的Cys巰基與Cd2+形成配位鍵，進(jìn)而形成PCs-Cd復(fù)合物,由轉(zhuǎn)運蛋白運輸?shù)揭号葸M(jìn)行區(qū)隔化[28]，本研究發(fā)現(xiàn)， 孔雀草根、莖中PCs含量隨鎘濃度增加呈先上升后下降趨勢，低中Cd濃度促進(jìn)葉PCs合成，高Cd濃度降低了PCs的合成。馮倩等研究表明，萬壽菊(TageteserectaL.)莖葉中PCs含量隨鎘濃度升高而增加，但在高Cd濃度處理下，莖葉PCs含量大幅下降[29]。除重金屬Cd以外，其他重金屬也能誘導(dǎo)植物合成PCs，但PCs對這些重金屬離子是否有解毒作用尚不清楚，有文獻(xiàn)報道，PCs并非都參與植物對重金屬的耐受機制，如在Zn抗性植物歐洲丁香(SyringavulgarisL.)中，低分子量有機酸而非PCs參與了胞內(nèi)Zn2+的結(jié)合[30]。

4 結(jié) 論

不同濃度鎘脅迫能誘導(dǎo)孔雀草低分子質(zhì)量巰基化合物的產(chǎn)生，適當(dāng)Cd濃度處理提高了孔雀草根、莖、葉NPT、PCs物質(zhì)的含量，影響Cys和GSH代謝，不同程度提高GSH/ GSSG值，說明低分子質(zhì)量巰基物質(zhì)參與孔雀草對Cd的耐性及解毒過程。