紅松種胚發(fā)育過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化

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(齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

種子與胚胎發(fā)育是植物有機(jī)體發(fā)育的最初階段，也是植物生命周期中尤為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。從種胚的形成和發(fā)育階段入手開(kāi)展研究是了解種子發(fā)育過(guò)程及機(jī)理的重要途徑。眾多研究表明，植物種子發(fā)育過(guò)程需要通過(guò)可溶性糖、淀粉、蛋白質(zhì)等內(nèi)含物質(zhì)含量的變化以保證種子與胚胎的正常發(fā)育。因此研究種胚發(fā)育過(guò)程中內(nèi)含物質(zhì)指標(biāo)的變化規(guī)律有利于了解種胚成熟的演變過(guò)程和發(fā)育機(jī)理。近年來(lái)，有關(guān)于被子植物種子形態(tài)發(fā)育過(guò)程與生理特性的研究已有許多報(bào)道[1-5]，由于裸子植物種子胚胎發(fā)育周期長(zhǎng)、取材難度大，目前對(duì)于裸子植物種子發(fā)育過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的變化研究相對(duì)較少[6-7]。紅松(Pinuskoraiensis)為松科松屬常綠針葉喬木，國(guó)家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物，有植物界“活化石”美譽(yù)，是溫帶地帶性頂極群落——闊葉紅松林的建群種，也是我國(guó)以及東亞地區(qū)極為重要的優(yōu)質(zhì)珍貴用材和經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，紅松種子富含多種營(yíng)養(yǎng)元素，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，具有降低血脂、膽固醇和甘油三酯的作用[8-9]。但目前紅松生產(chǎn)過(guò)程中存在結(jié)實(shí)大小年，種子生產(chǎn)周期長(zhǎng)，結(jié)實(shí)量低等問(wèn)題。為深入了解紅松種胚發(fā)育過(guò)程與成熟機(jī)制，以處于胚胎發(fā)育不同時(shí)期的紅松種子作為研究材料，監(jiān)測(cè)種胚形態(tài)發(fā)育過(guò)程的同時(shí)，分析發(fā)育過(guò)程中可溶性糖、淀粉與蛋白質(zhì)含量變化；通過(guò)分析紅松種胚發(fā)育過(guò)程的主要內(nèi)含物質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)變化，揭示種子發(fā)育過(guò)程中的生理特性和重要指標(biāo)的變化規(guī)律，探討紅松種胚發(fā)育成熟的機(jī)制，為探明紅松種胚發(fā)育生理過(guò)程及其分子作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為有效調(diào)控種子成熟期及種子生產(chǎn)提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐，也為體胚發(fā)生過(guò)程中碳源及有機(jī)物的添加提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在黑龍江省葦河林業(yè)局紅松種子園進(jìn)行，該區(qū)地處128°3′E，44°40′N(xiāo)，長(zhǎng)白山脈與小興安嶺的中間地帶。海拔300 m，無(wú)霜期130 d，年積溫2 700～3 000 ℃，年平均氣溫3 ℃，年降水量600～800 mm，主風(fēng)向冬季多西北風(fēng)，夏季多東南風(fēng)，森林暗棕壤，土層厚度40～80 cm，pH值在5.5～6.5之間，微酸性和中性土壤。紅松初級(jí)種子園于1983年采用鶴北林業(yè)局天然紅松母樹(shù)林接穗，圃地嫁接，1984年定植，樹(shù)高7.8～8 m，胸徑20～22 cm[10]。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

紅松種胚采自黑龍江省葦河紅松種子園中開(kāi)放授粉無(wú)性系(057)，參照Yan 等[11]的取材方法，分別采集無(wú)性系固定單株向陽(yáng)中部5個(gè)球果，從2016年6月15日至8月30日每隔1周采集樣品，未成熟球果采集后用冰盒在24 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室后立即用器械去除種鱗和種皮并取出種子，選擇球果中間部分健康發(fā)育的種子采用體視解剖鏡(OLYMPUS SZX 7)進(jìn)行種子形態(tài)學(xué)和胚胎發(fā)育時(shí)期鑒定并拍照。將分別處于原胚期、裂生多胚期、柱狀胚期、子葉胚前期、子葉胚期中同一發(fā)育時(shí)期的種子取出，每個(gè)球果中各取60粒種子(包含雌配子體和合子胚)均勻混合，液氮速凍后-80 ℃保存，用于生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 種子形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定

采用游標(biāo)卡尺及電子天平分別測(cè)定紅松種子長(zhǎng)、寬、重量，其中以30粒種子為1個(gè)重復(fù)，重復(fù)3次[7,12]。

1.3.2 生理指標(biāo)的測(cè)定

選取低溫保存的授粉后3周(階段1)、5周(階段2)、7周(階段3)、9周(階段4)、11周(階段5)的種子，分別測(cè)定其可溶性糖、淀粉、蛋白質(zhì)含量?？扇苄蕴呛康奶崛∨c質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[13]；可溶性淀粉含量的測(cè)定采用NBT(氮藍(lán)四唑)光還原法進(jìn)行測(cè)定[13]；可溶性蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法進(jìn)行測(cè)定[14]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003軟件和SPSS 17.0分析軟件進(jìn)行分析處理，用鄧肯氏新復(fù)極差法(Duncan)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，圖中數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅松種胚發(fā)育進(jìn)程的解析

紅松種子在發(fā)育過(guò)程中，種子及胚胎的形態(tài)特征發(fā)生顯著的變化(見(jiàn)圖1)。6月下旬(授粉后3周)紅松種子呈透明狀，胚胎處于原胚期(圖1中原胚期種子)；7月初(授粉后5周)紅松種子較原胚期體積增大，種子逐漸變?yōu)椴煌该?，原胚柄伸長(zhǎng)并推動(dòng)胚胎更深入雌配子體中，進(jìn)入裂生多胚期(圖1階段2)，胚柄進(jìn)一步發(fā)育的同時(shí)，溶蝕腔內(nèi)同時(shí)發(fā)育多個(gè)具有胚頭和胚柄的胚胎，多胚胎間競(jìng)爭(zhēng)后保留一個(gè)優(yōu)勢(shì)胚胎進(jìn)一步發(fā)育，其他幼胚逐漸退化解體，7月中旬(授粉后7周)紅松種子變?yōu)榘咨?，胚胎發(fā)育成為一個(gè)伸長(zhǎng)的圓柱體，優(yōu)勢(shì)柱狀胚的胚頭變大，胚柄伸長(zhǎng)，胚胎發(fā)育進(jìn)入柱狀胚期(圖1階段3)，7月底至8月初(授粉后9周)，種子大小與成熟時(shí)接近，去掉外種皮后的種子呈現(xiàn)不透明的乳白色，胚柄稍有退化，分化出子葉(此時(shí)多片子葉合生尚未分離)，預(yù)示著已進(jìn)入子葉胚前期的發(fā)育階段(圖1階段4)；8月中下旬(授粉后11周)，種子質(zhì)地變得堅(jiān)硬，乳白色基礎(chǔ)上變?yōu)槿辄S色，胚柄基本上已退化，子葉進(jìn)一步發(fā)育，多片子葉先端出現(xiàn)分離，發(fā)育至此，紅松種子及胚胎形態(tài)上發(fā)育成熟，進(jìn)入成熟的子葉胚期。

圖1 不同胚胎發(fā)育階段的紅松種子(上排)與合子胚(下排)形態(tài)

2.2 紅松種子發(fā)育過(guò)程中形態(tài)指標(biāo)的變化

紅松種子發(fā)育過(guò)程中橫徑、縱徑、重量變化情況見(jiàn)表1。整體來(lái)看，紅松種子大小的發(fā)育先后經(jīng)歷了快速生長(zhǎng)與慢速生長(zhǎng)2個(gè)階段。其中，原胚期至子葉胚前期(授粉后3～9周)是紅松種子的快速生長(zhǎng)階段，期間種子縱徑與橫徑均呈顯著性增加，其中平均縱徑從11.72 mm(原胚期)增加至17.73 mm(子葉前胚期)，平均橫徑從5.18 mm(原胚期)增加至9.18 mm(子葉前胚期)；子葉胚前期至子葉胚期種子生長(zhǎng)速度較慢，此時(shí)種子大小趨于穩(wěn)定。方差分析結(jié)果表明，除子葉胚前期與子葉胚期種子橫徑與縱徑增加均不顯著外，其余各發(fā)育時(shí)期的縱徑與橫徑均差異顯著(p<0.05)。紅松種子發(fā)育過(guò)程重量變化的方差分析結(jié)果表明，發(fā)育早期(原胚期至裂生多胚期)紅松種子重量增加不顯著；裂生多胚期至子葉胚前期種子重量增加顯著，發(fā)育至子葉胚前期種子平均重量由裂生多胚期的158.96 mg增至571.2 mg，增加了3.59倍；隨后的發(fā)育過(guò)程中種子重量增加不顯著(p<0.05)。

表1 紅松種子生長(zhǎng)發(fā)育的形態(tài)差異

發(fā)育時(shí)期種子縱徑(mm)種子橫徑(mm)種子重量(mg)111.72±0.688d5.18±0.334d206.12±30.56a213.14±0.374c6.27±0.572c158.96±49.05a315.11±0.363b7.39±0.496b363.26±40.86b417.73±0.682a9.18±0.622a571.2±34.15c518.72±0.834a9.4±0.333a581.77±49.59c

注：同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.3 紅松種子發(fā)育過(guò)程中可溶性糖、淀粉與蛋白質(zhì)含量的變化

不同發(fā)育階段紅松種子可溶性糖、淀粉與蛋白質(zhì)含量變化結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同發(fā)育時(shí)期紅松種子可溶性糖、淀粉與蛋白質(zhì)含量變化

研究結(jié)果表明，紅松種子發(fā)育過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量隨著種胚形態(tài)發(fā)育的變化而發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，各自呈現(xiàn)不同的變化格局。在紅松種子發(fā)育過(guò)程中，可溶性糖含量呈現(xiàn)先快速增加隨后迅速降低的變化趨勢(shì)。原胚期可溶性糖含量最低，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為54.88 mg/g，原胚期至柱狀胚期含量隨種子的發(fā)育呈現(xiàn)逐漸遞增的變化趨勢(shì)，柱狀胚期達(dá)到峰值(81.53 mg/g)，隨后的發(fā)育過(guò)程中可溶性糖含量迅速降低，在接近成熟的子葉胚期可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)回落到61.8 mg/g(FW)，接近裂生多胚期的水平。方差分析結(jié)果表明，除子葉胚期與裂生多胚期可溶性糖含量差異不顯著外，各取樣期可溶性糖含量均差異顯著(p<0.05)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，可溶性糖在紅松種胚發(fā)育早期大量積累，分析其可能為種胚的形態(tài)建成與器官分化過(guò)程提供能量。

在原胚期至子葉胚前期可溶性淀粉含量呈逐漸遞增的變化趨勢(shì)，隨后的發(fā)育淀粉含量一直維持在較高的水平。進(jìn)一步方差分析結(jié)果表明，除子葉胚期與子葉胚前期含量差異不顯著外，其余各時(shí)期淀粉含量均差異顯著(p<0.05)，子葉胚前期與子葉胚期淀粉含量(子葉胚前期為146.42 mg/g(FW)，子葉胚期為144.9 mg/g(FW))約為原胚期含量(25.51 mg/g(FW))的5～6倍。上述結(jié)果表明淀粉在紅松種胚發(fā)育晚期迅速積累，在種胚發(fā)育晚期淀粉維持較高的水平可為種子后期的進(jìn)一步成熟與脫水過(guò)程奠定基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)研究中可溶性蛋白質(zhì)含量變化趨勢(shì)與淀粉類(lèi)似，但在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中蛋白含量均維持在較低的水平，原胚期至子葉胚前期含量逐漸增加，蛋白質(zhì)合成速度逐漸加快；隨后的發(fā)育過(guò)程中含量趨于穩(wěn)定，子葉胚前期蛋白質(zhì)含量為7.37 mg/g，子葉胚期為7.33 mg/g。方差分析結(jié)果表明，除子葉胚期與子葉胚前期蛋白質(zhì)含量差異不顯著外，其余各時(shí)期含量均差異顯著(p<0.05)。上述結(jié)果表明，蛋白質(zhì)含量隨著種胚的發(fā)育成熟逐漸增加，發(fā)育至子葉胚前期蛋白質(zhì)合成速度降低，致使子葉胚前期與子葉胚期蛋白質(zhì)含量達(dá)到峰值并趨于穩(wěn)定。在紫荊(Cercischinensis)種子成熟過(guò)程的研究中也發(fā)現(xiàn)在種子發(fā)育后期貯藏類(lèi)物質(zhì)積累，與本研究結(jié)果類(lèi)似[15]。

3 結(jié)論與討論

種子與胚胎的發(fā)育是紅松生殖生長(zhǎng)中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。本研究通過(guò)紅松種子發(fā)育過(guò)程的解析發(fā)現(xiàn)其種胚發(fā)育遵循松屬的種胚發(fā)育特征，其外部形態(tài)變化明顯，胚胎發(fā)育從受精卵開(kāi)始先后經(jīng)歷原胚期、裂生多胚期、柱狀胚期、子葉胚前期、子葉胚期等幾個(gè)發(fā)育階段[16-18]。原胚期至子葉胚前期是紅松種胚生長(zhǎng)發(fā)育的高峰期，子葉胚前期的種子縱徑與橫徑最大，裂生多胚期至子葉胚前期種子重量顯著增加。上述紅松種子縱徑、橫徑、鮮重變化規(guī)律與百子蓮(Agapanthuspraecox)[1]、棕櫚(Trachycarpusfortunei)[4]、牡丹(Paeoniasufruticosa)[5]等植物的種子發(fā)育情況相似。

植物種子發(fā)育過(guò)程需要通過(guò)可溶性糖、淀粉、蛋白質(zhì)等內(nèi)含物質(zhì)含量的變化以保證種子與胚胎的正常發(fā)育[19]。種胚的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)需要能量的過(guò)程，可溶性糖是生物體生命活動(dòng)能量的源泉，可為種胚生長(zhǎng)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量[20]，參與發(fā)育后期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)存積累[21-23]，也作為關(guān)鍵的發(fā)育信號(hào)調(diào)控種子發(fā)育早期細(xì)胞分裂和擴(kuò)增等過(guò)程[24]。在本研究中可溶性總糖含量呈先升后降的變化趨勢(shì)，峰值出現(xiàn)在柱狀胚期的種子中。據(jù)此分析在紅松種胚發(fā)育早期，細(xì)胞處于旺盛的分裂和分化階段，可溶性糖含量迅速積累，以滿足發(fā)育早期較高的能量需求來(lái)維持種胚正常的生長(zhǎng)發(fā)育。而在種子發(fā)育后期，可溶性糖用于蛋白質(zhì)和油脂等儲(chǔ)存物質(zhì)合成因而質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降的變化趨勢(shì)。

本研究中，可溶性淀粉含量在紅松種子發(fā)育前期與中期(階段1～4)呈逐漸遞增的變化趨勢(shì)，接近成熟期的種子中其含量維持在較高的水平并趨于穩(wěn)定，由此可見(jiàn)，紅松種子的發(fā)育表現(xiàn)為淀粉沉積的過(guò)程，與谷類(lèi)作物的種子發(fā)育類(lèi)似[25]?？梢?jiàn)在種子發(fā)育初期淀粉積累量少，轉(zhuǎn)化成總糖的也少，隨著種子的發(fā)育淀粉含量不斷增加，子葉胚前期開(kāi)始逐漸加大積累量，直至子葉胚期一直維持在較高的水平。

蛋白質(zhì)是種子發(fā)育過(guò)程所需氮素營(yíng)養(yǎng)的重要來(lái)源，蛋白質(zhì)的合成為種子與胚胎的正常發(fā)育奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。種子可溶性蛋白多為參與代謝活動(dòng)的酶類(lèi)，其含量的高低可間接反映植物體內(nèi)物質(zhì)代謝的強(qiáng)弱，因此常被作為評(píng)價(jià)植物代謝的重要生理指標(biāo)[26,7]。本研究中可溶性蛋白含量與淀粉變化趨勢(shì)近似，隨著種子的發(fā)育逐漸加大蛋白質(zhì)的積累量，這與板栗(Castaneamollissima)種子發(fā)育過(guò)程中蛋白質(zhì)含量變化趨勢(shì)一致[27]。由此可見(jiàn)，在紅松種胚后期的成熟過(guò)程中，需要有大量的蛋白質(zhì)參與，作為活躍的生理生化活性物質(zhì)參與細(xì)胞代謝過(guò)程，為種胚的繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育提供養(yǎng)分，此外，蛋白質(zhì)也作為紅松種胚形態(tài)建成的結(jié)構(gòu)組成物質(zhì)發(fā)揮作用。

本研究在監(jiān)測(cè)紅松種胚發(fā)育形態(tài)演變過(guò)程的同時(shí)，對(duì)幾種生理指標(biāo)的變化規(guī)律進(jìn)行了初步的探討。研究結(jié)果表明，在紅松種胚發(fā)育早期可溶性糖大量積累，為種胚的發(fā)育提供能量，而可溶性淀粉與蛋白的大量積累則發(fā)生在種子發(fā)育后期。本研究結(jié)果證實(shí)了紅松種胚發(fā)育過(guò)程中可溶性糖、淀粉與蛋白質(zhì)含量的變化與其發(fā)育狀態(tài)密切相關(guān)，幾種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)共同參與調(diào)控紅松種胚的生長(zhǎng)發(fā)育。研究結(jié)果在一定程度上揭示了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在紅松種胚發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式，可為紅松及其他針葉樹(shù)種胚發(fā)育的研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為種子園經(jīng)營(yíng)管理提供參考。此外，發(fā)育過(guò)程中生理指標(biāo)變化規(guī)律也可為體胚發(fā)生過(guò)程中碳源及有機(jī)物的添加提供理論依據(jù)。