肖何 張艷 王永瑞 倪永清
(新疆石河子大學(xué)食品學(xué)院,石河子 832000)
魚類含有很多促進(jìn)人類健康的化合物,如優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì),維生素(A、D、E和B12),硒和碘以及對(duì)心臟有益的多不飽和脂肪酸,尤其是二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸對(duì)心律失常,癌癥和高血壓患者非常有益,并且在維持神經(jīng)功能和預(yù)防某些精神疾病方面發(fā)揮重要作用[1]。其中,生活在水溫常年低于20℃的額爾齊斯河流域的新疆冷水魚類,因其肉質(zhì)鮮美和獨(dú)特的口感廣受消費(fèi)者青睞。因此,野生冷水魚類已經(jīng)不能滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的消費(fèi)需求,人們開始對(duì)冷水魚進(jìn)行人工養(yǎng)殖。然而,為了預(yù)防和治療在漁業(yè)養(yǎng)殖中發(fā)生的疾病,抗生素被廣泛應(yīng)用于漁業(yè)產(chǎn)品。研究顯示發(fā)展中國(guó)家90%的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)存在抗生素使用監(jiān)督不完善,這導(dǎo)致抗生素污染水體,此外,水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)通常位于河口,來自人類和動(dòng)物糞便中的抗生素耐藥菌株便也會(huì)污染水體[2-3]。水中抗生素殘留的選擇性壓力會(huì)誘導(dǎo)抗生素耐藥菌的形成,因此,水生環(huán)境中的抗生素殘留是一個(gè)潛在的危害。水中生活的魚類是較容易受到生存水體污染的漁業(yè)產(chǎn)品,如棲息于水中的耐藥細(xì)菌等,而食源性耐藥細(xì)菌可以通過食物鏈在人類腸道定殖,這使得漁業(yè)產(chǎn)品中抗生素耐藥性的問題很令人關(guān)注。
Enterococcus是一種能夠耐受許多極端環(huán)境[4],且自然界廣泛分布的細(xì)菌,如植物、動(dòng)物(包括人類)胃腸道、土壤、海水、淡水及其他廢水等[5-7]。不僅如此,腸球菌通過質(zhì)粒、染色體或攜帶抗性基因的轉(zhuǎn)座子,能夠快速高效的獲得對(duì)幾乎所有臨床用抗生素的耐藥性[8]。如臨床開始使用氯霉素,紅霉素和四環(huán)素后,腸球菌很快就出現(xiàn)了對(duì)它們的耐藥性,在某些案例中甚至達(dá)到了阻止了它們?cè)谂R床上基于經(jīng)驗(yàn)主義治療的使用。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署將腸球菌作為水體污染程度的指示菌[9],因此,腸球菌是一種較為理想的用來評(píng)估漁業(yè)產(chǎn)品抗生素耐藥性的指示菌。本研究以E. faecium為代表性菌株對(duì)新疆阿勒泰的冷水魚進(jìn)行抗生素耐藥及毒力因子的檢測(cè),評(píng)估其食品安全性,以期為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的抗生素耐藥性擴(kuò)散問題的評(píng)估提供理論參考依據(jù)。
1.1.1 樣品及菌株 39條新疆冷水魚類購(gòu)買于阿勒泰水產(chǎn)品零售商店(全部為當(dāng)天捕獲),包括1條細(xì)鱗鮭;1條高白鮭;3條溪紅點(diǎn)鮭;2條歐洲丁鱥;1條大麻哈魚;1條長(zhǎng)頜白鮭;1條東方歐鳊;5條貝爾加雅羅魚;2條赤眼鱒;1條黑斑狗魚;1條白斑狗魚;2條河鱸;3條梭鱸;2條異育銀鯽;3條江鱈;1條紅尾魚;1條哲羅鮭;3條鯽魚和3條草魚。標(biāo)記后于4℃車載冰箱內(nèi)冷藏,12 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。藥敏實(shí)驗(yàn)用質(zhì)控菌株Enterococcus faecium(CGMCC 1.2136)購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。
1.1.2 培養(yǎng)基 改良MRS培養(yǎng)基主要成分為葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、牛肉膏 10 g、酵母浸提物5 g、檸檬酸二胺 2 g、磷酸氫二胺2 g、乙酸鈉5 g、MgSO4.7H2O 0.58 g、MnSO4.4H2O 0.25 g、 吐 溫 -80 1 mL、蒸餾水1 000 mL(調(diào)pH 6.2-6.4);腸球菌瓊脂(膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂)(BAA)培養(yǎng)基購(gòu)自于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。
1.1.3 主要試劑和儀器 12種藥敏紙片購(gòu)自于英國(guó)OXOID;PCR 反應(yīng)相關(guān)試劑購(gòu)自于上海生工生物工程有限公司;擴(kuò)增引物均購(gòu)自于上海捷瑞生物工程有限公司;DNA 分子量 maker 購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。高速冷凍離心機(jī)為Fresco21型(德國(guó)Thermo公司);PCR儀為德國(guó)Biometra公司Tprofessional;凝膠成像系統(tǒng)為法國(guó)Vilber多功能成像系統(tǒng);水平電泳儀為美國(guó)Bio-Rad公司PowerPac Universal。
1.2.1 腸球菌分離純化 75%(V/V)酒精擦拭整個(gè)冷水魚體,超凈工作臺(tái)中解刨冷水魚,移出整個(gè)腸道;75%(V/V)酒精擦拭整個(gè)腸道的外表面,滅菌解剖剪剖開腸道,收集腸道內(nèi)溶物和粘液。稱取1 g內(nèi)溶物和粘液與99 mL無菌生理鹽水混勻,后取0.1mL勻漿進(jìn)行梯度稀釋后,涂布在MRS,M17,BAA 3種固體培養(yǎng)基上,置于16℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)4 d后,連續(xù)轉(zhuǎn)接劃線培養(yǎng)3次后得到單菌落。
1.2.2 菌株 DNA 的提取 采用urea-SDS-NaOH方法提取菌株DNA[10],保存至-20℃即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
1.2.3 屎腸球菌種、屬鑒定 將革蘭氏染色陽性,接觸酶試驗(yàn)陰性且鏡檢下細(xì)胞形態(tài)為球狀的細(xì)菌用Enterococcus sp引物擴(kuò)增[11],確定其為Enterococci屬,以模式菌E. faeciumCGMCC 1.2136為陽性對(duì)照,再采用E. faecium的種引物擴(kuò)增[10],確定到具體種(表 1)。
表1 種屬鑒定特異性引物
1.2.4 16S rRNA基因測(cè)序及數(shù)據(jù)處理 采用通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系(25 μL):2×EsTaq Master Mix 12.5 μL,10 μmol/L 27F 0.5 μL,10 μmol/L 1492R 0.5 μL,100 ng/μL DNA 模板 1 μL,ddH2O 10.5 μL。PCR反應(yīng)程序:94℃ 5 min;94℃30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,35 次循環(huán) ;72℃ 10min。取 3 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物于 1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行目的片段的電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物由上海生工生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序所得16S rDNA序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫,用BLAST進(jìn)行相關(guān)序列的搜索,與GenBank數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有的近緣菌株序列比較,序列的同源性大于等于99%,則可認(rèn)為菌株為該種。
1.2.5 藥敏性測(cè)定 利用K-B紙片法進(jìn)行藥敏性測(cè)定,藥敏紙片:氨芐青霉素(AMP,10 μg)、青霉素(P,10 IU)、慶大霉素(CN,120 μg)、鏈霉素(S,300 μg)、萬古霉素(VA,30 μg)、環(huán)丙沙星(CIP,5 μg)、 四 環(huán)素(TE,30 μg)、紅 霉 素(E,15 μg)、呋喃妥因(F,300 μg)、利奈唑胺(LZD,30 μg)、氯霉素(C,30 μg)、奎奴普?。≦D,15 μg)。結(jié)果參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)將供試菌判讀為敏感、中介和耐藥3種。
1.2.6 PCR檢測(cè)紅霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、氨芐青霉素和萬古霉素耐藥基因[11-14]耐藥基因引物序列及退火溫度如表2所示,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體系 25 μL,2×EsTaq Master Mix 12.5 μL,10 μmol/L 引物各 0.5 μL,100 ng/μL DNA 模板 1 μL,ddH2O 10.5μL。PCR反應(yīng)程序:94℃ 5 min;94℃ 1 min,合適溫度1 min,72℃ 2 min,30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。
表2 耐藥基因引物序列及相應(yīng)退火溫度
1.2.7 PCR檢測(cè)毒力基因 毒力基因引物序列[15]及相應(yīng)退火溫度見表3,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體系 25 μL,2×EsTaq Master Mix 12.5 μL,10 μmol/L引 物 各 0.5 μL,100 ng/μL DNA 模 板 1 μL,ddH2O 10.5 μL。PCR 反應(yīng)程序:95℃ 5 min;94℃ 30 s,合適溫度1 min,7℃ 1 min,30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。
表3 毒力基因引物信息及相應(yīng)退火溫度
經(jīng)鏡檢、革蘭氏染色、接觸酶試驗(yàn)及種屬特異性引物PCR擴(kuò)增,從39條冷水魚的腸道中分離到13株屎腸球菌(表4)。16S rDNA基因測(cè)序結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫,經(jīng)過比對(duì)確定為屎腸球菌。13株屎腸球菌中有5株菌來自3條溪紅點(diǎn)鮭,4株菌來自1條高白鮭,3株菌來自2條異育銀鯽,最后1株來自1條歐洲丁鱥;其余冷水魚腸道未分離到屎腸球菌。
13株屎腸球菌對(duì)12種抗生素的敏感性如表5所示。13株屎腸球菌都對(duì)氨芐青霉素、青霉素G、慶大霉素、萬古霉素、四環(huán)素、紅霉素、呋喃妥因、利奈唑胺和奎奴普丁/達(dá)福普敏感。除屎腸球菌YEY1-1和YMY1-1外,其余11株屎腸球菌均對(duì)環(huán)丙沙星中介(即中度敏感)。此外,屎腸球菌MQ-1和EQ1-1對(duì)鏈霉素中介(即中度敏感)。
表4 13株屎腸球菌的具體來源信息
四環(huán)素、環(huán)丙沙星、氨芐青霉素、紅霉素和萬古霉素耐藥基因在屎腸球菌中的分布如表6所示。屎腸球菌都不攜帶氨芐青霉素耐藥基因Bla、紅霉素耐藥基因ermB、ermC及萬古霉素耐藥基因vanA、vanB、vanC1和vanC2-C3。所有屎腸球菌都攜帶環(huán)丙沙星耐藥基因gyrA,甚至有2株屎腸球菌同時(shí)攜帶另一個(gè)環(huán)丙沙星耐藥基因parC。在5個(gè)四環(huán)素耐藥基因中,屎腸球菌都對(duì)tetS和tetO的PCR結(jié)果呈陰性,此外僅有1株屎腸球菌攜帶tetK基因,4株屎腸球菌同時(shí)攜帶tetM和tetL基因,還有1株屎腸球菌僅攜帶tetL基因。
表5 十三株屎腸球菌對(duì)十二種抗生素的敏感性
表6 十三株屎腸球中耐藥基因的分布
13株屎腸球菌對(duì)8種毒力因子的PCR擴(kuò)增結(jié)果(表7)顯示,全部屎腸球菌不攜帶任何一種毒力因子。
抗生素是一類主要用于治療各種細(xì)菌感染或致病微生物感染類疾病的藥物,它具有成本低、使用方便、療效顯著等特點(diǎn),因而被廣泛使用。中國(guó)作為世界第一的水產(chǎn)養(yǎng)殖國(guó)家,每年的養(yǎng)殖產(chǎn)量為世界養(yǎng)殖總產(chǎn)量的70%左右[16]。這與其養(yǎng)殖模式有很大關(guān)系,尤其是密集型漁業(yè)養(yǎng)殖模式,但這種養(yǎng)殖模式為致病菌迅速生長(zhǎng)提供了很好的契機(jī),導(dǎo)致了水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌性疾病的發(fā)病率極高[16-17]。因此,抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛的應(yīng)用來控制這些疾病,使得漁業(yè)產(chǎn)品存在抗生素殘留的問題[17]??股貧埩魰?huì)誘導(dǎo)耐藥菌株的產(chǎn)生,因此許多關(guān)于養(yǎng)殖魚類的研究都報(bào)道了耐藥菌株[18-19],不僅如此,臨床常用抗生素的耐藥性也在養(yǎng)殖魚類中有報(bào)道。如Broughton和Walker對(duì)廣東100條淡水養(yǎng)殖魚的研究,發(fā)現(xiàn)分離的菌株全部對(duì)紅霉素和氨芐青霉素耐藥[20],然而本研究的冷水魚腸道屎腸球菌對(duì)所測(cè)試的抗生素均未表現(xiàn)出耐藥性。研究表明水產(chǎn)品(魚、蝦等)中的抗生素含量與其生活習(xí)性,食物鏈等級(jí)和產(chǎn)品特征有關(guān),因此本研究中13株屎腸球菌的敏感性很可能與冷水魚生活的水層、底棲生物有關(guān),但其具體原因有待進(jìn)一步深入研究[21]。分諾酮類藥物進(jìn)行管理和控制,其使用量在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的減少有關(guān)[23]。盡管沒有檢測(cè)到耐藥性,但屎腸球菌均攜帶環(huán)丙沙星耐藥基因,這一現(xiàn)象應(yīng)該引起人們的關(guān)注,因此,加強(qiáng)抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的合理及規(guī)范化使用很有必要。
表7 13株屎腸球中毒力因子的分布
本研究腸球菌的抗生素耐藥表型及常見抗生素耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果表明冷水魚的安全性較高,不僅如此,13株菌不攜帶所檢測(cè)的任何一種毒力因子,而研究發(fā)現(xiàn)腸球菌要引起感染,必須攜帶毒力因子幫助其定殖宿主組織并逃避宿主免疫防御機(jī)制[24],這又進(jìn)一步說明了冷水魚的安全性,因此冷水魚的消費(fèi)對(duì)消費(fèi)者身體健康并不存在安全隱患。
應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的抗生素種類主要有喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類等[16],因此,本研究檢測(cè)了環(huán)丙沙星、四環(huán)素、紅霉素、萬古霉素及氨芐青霉素的耐藥基因。其中喹諾酮類抗生素(如環(huán)丙沙星,諾氟沙星等)是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中使用率很高的抗生素,因此其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的檢出率很高[22]。Liu等[17]對(duì)234份中國(guó)漁業(yè)產(chǎn)品抗生素殘留的研究進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后,發(fā)現(xiàn)漁業(yè)產(chǎn)品對(duì)6個(gè)種類的32種不同抗生素呈陽性,其中喹諾酮類抗生素是最常檢出的抗生素,分析抗生素具體種類發(fā)現(xiàn),最少有10例研究對(duì)環(huán)丙沙星呈陽性。然而本研究中的屎腸球菌對(duì)環(huán)丙沙星并未表現(xiàn)出耐藥性,該結(jié)果很可能與我國(guó)政府在2016年開始對(duì)食用動(dòng)物使用部
對(duì)13株阿勒泰冷水魚腸道屎腸球菌進(jìn)行了耐藥性、常用抗生素的耐藥基因、毒力基因的分析。13株屎腸球菌不攜帶任何毒力基因,且并未表現(xiàn)出對(duì)測(cè)試抗生素的耐藥性。此外,常用抗生素耐藥基因的整體檢出率很低。綜上所述,認(rèn)為新疆阿勒泰冷水魚食品安全性很高,對(duì)消費(fèi)者的身體健康不具有潛在危害。