馬鈴薯瘡痂病拮抗菌的篩選鑒定及防治效果初探

李玉聰 李濱影 油心怡 劉宇豪 周波 林榕姍，2

（1. 山東農業(yè)大學，泰安 271018；2. 農業(yè)部農業(yè)微生物資源收集與保藏重點實驗室，北京 100081）

馬鈴薯是世界第四大糧食作物，在全球各地均有廣泛栽培，我國是世界最大的馬鈴薯生產國。馬鈴薯瘡痂病是馬鈴薯的主要病害之一，近年來在我國各馬鈴薯種植區(qū)普遍發(fā)生。該病可由多種鏈霉菌引起，主要包括Streptomyces scabies、S. acidiscabies和S.turgidiscabies等［1］，并且不斷有新的病原鏈霉菌被報道［2-4］。感病馬鈴薯塊莖表面形成凸起狀、凹陷狀或平狀的病斑，病斑區(qū)域的細胞木栓化，呈痂狀［5］。馬鈴薯瘡痂病可影響薯塊的外觀和品質，降低其商品價值［6-7］，病情嚴重時影響馬鈴薯出苗，導致減產［8］，給我國的馬鈴薯生產造成了極大的經濟損失。目前對于該病還缺少很好的防治方法，而探索有效的生物防治方法正逐漸引起人們的重視。本研究以馬鈴薯瘡痂病病原菌Streptomyces bottropensisAMCC400023為靶標菌株，從山東省高密市馬鈴薯種植地采集的土壤中分離篩選對馬鈴薯瘡痂病有拮抗作用的菌種，通過菌體形態(tài)觀察、革蘭氏染色、生理生化測定及16S rDNA基因序列分析對一株拮抗能力較強的菌株進行鑒定，并進行盆栽防病效果測定，旨在為馬鈴薯瘡痂病的生物防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g、酵母浸膏5.0 g、NaCl 10.0 g、水1 000 mL，pH 7.0-7.4。LB固體培養(yǎng)基：每1 000 mL LB液體培養(yǎng)基加入瓊脂20.0 g。高氏Ⅰ號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0 g、KNO31.0 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂 20.0 g、水 1 000 mL，pH 7.2-7.4。燕麥瓊脂培養(yǎng)基：燕麥片20.0 g加入水中煮沸約20 min，經紗布過濾，加水定容至1 000 mL，加入瓊脂20.0 g，pH 7.2。檸檬酸鹽培養(yǎng)基：檸檬酸鈉 2.0 g、K2HPO41.0 g、NH4H2PO41.0 g、NaCl 5.0 g、MgSO40.2 g、瓊脂20.0 g、1%溴麝香草酚藍水溶液10.0 mL，pH 6.8。阿拉伯糖培養(yǎng)基：胰蛋白胨2.7 g、NaCl 5.0 g、K2HPO40.3 g、1%溴麝香草酚藍水溶液3.0 mL、瓊脂5.0 g、水1 000 mL，pH 7.0。木糖-明膠培養(yǎng)基：0.2%酚紅溶液25 mL、明膠120 g、水1 000 mL，pH 7.6。以上培養(yǎng)基于121℃滅菌30 min后使用。

1.1.2 供試菌株 馬鈴薯瘡痂病病原菌：Streptomyces bottropensisAMCC400023，來源于山東農業(yè)大學山東農業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.3 土壤樣品 土壤樣品采集于山東省高密市李家營鎮(zhèn)、孟家莊、張家莊、城律村、祝家莊的馬鈴薯瘡痂病病發(fā)地。采集時除去發(fā)病地塊表層5 cm土壤，取5-15 cm深層土壤，每份樣品10 g。

1.1.4 供試馬鈴薯 拮抗菌的盆栽防效測定試驗中所用馬鈴薯品種為荷蘭15號。

1.2 實驗方法

1.2.1 病原菌孢子懸液的制備 將馬鈴薯瘡痂病病原菌Streptomyces bottropensisAMCC400023接種于燕麥瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3-5 d。用無菌水沖洗下孢子，轉入100 mL離心管中，4℃、8 000 r/min離心20 min，棄上清，用20%的甘油液重懸孢子，分裝于2 mL離心管中，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗菌的分離與初篩 取1.0 g土壤樣品加入99 mL無菌水，37℃、180 r/min充分振蕩30 min，后80℃水浴20 min。取適量土壤懸濁液梯度稀釋后涂布于LB培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落，純化，接種至LB培養(yǎng)基斜面，37℃培養(yǎng)24 h，菌種于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩２捎闷桨鍖χ派L法進行拮抗菌的初篩。取100 μL病原菌孢子懸液涂布于高氏Ⅰ號培養(yǎng)基平板，并將已活化的待篩選菌種點接至培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3-5 d，觀察是否產生抑菌圈，比較抑菌圈的大小，選擇抑菌圈較大的菌株進行復篩試驗。

1.2.3 拮抗菌的復篩 采用牛津杯法進行復篩試驗。將純化后的待篩選拮抗菌分別接入等量LB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)好的菌液12 000r/min離心20 min，收集上清液，經0.22 μm水系微孔濾膜過濾除去菌體，制得拮抗菌的無菌上清液。吸取適量無菌上清液涂布于高氏一號培養(yǎng)基平板，將3個無菌牛津杯置于培養(yǎng)基上，使3個牛津杯圍繞培養(yǎng)基中心點呈三角形。在其中兩個牛津杯中各加入200 μL無菌上清液，另一個牛津杯加入等體積的無菌LB液體培養(yǎng)基作為對照。28℃培養(yǎng)5-7 d后查看結果，對有拮抗效果的菌株使用游標卡尺通過十字交叉法測量并記錄其抑菌圈直徑，根據抑菌圈直徑大小衡量各菌株的拮抗能力，并重復3次復篩試驗以確認結果。選擇一株拮抗能力優(yōu)良的菌株進行后續(xù)實驗。

1.2.4 菌體形態(tài)觀察 將拮抗菌接種于LB培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落的形態(tài)特征（包括形態(tài)、大小、顏色、邊緣、表面、透明度等），并對菌株進行革蘭氏染色并油鏡鏡檢。

1.2.5 生理生化測定 參照《伯杰細菌鑒定手冊》［9］和《常見細菌系統鑒定手冊》［10］的實驗方法，對拮抗菌的接觸酶試驗、V-P試驗、檸檬酸鹽利用、阿拉伯糖利用、木糖利用以及耐鹽性等生理生化指標進行測定。

1.2.6 16S rDNA 基因序列分析 使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取拮抗菌DNA。選用16S rDNA通用引物（27F/1 492R）進行PCR擴增。正向引物（27F）：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′， 反 向引 物（1 492R）：5′-CTACGGCTACCTTGTTACA-3′。PCR反應體系（25 μL）為：DNA模板2 μL10×PCR buffer 2.5 μL，正向引物（27F）0.5 μL，反向引物（1492R）0.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.25 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.25 μL，ddH2O 補 足 25 μL。PCR 結 束 后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行檢測，將擴增產物送交鉑尚生物技術有限公司進行測序。將菌株的16S rDNA基因序列與NCBI已知的核酸序列進行BLAST比對，獲得相近屬種菌株的相應基因序列，使用Clustal X、MEGA 7軟件構建系統發(fā)育樹。

1.2.7 拮抗菌對馬鈴薯瘡痂病的盆栽防效測定 選取健康的荷蘭15號馬鈴薯，用75%乙醇對其表面消毒，清水洗凈，置于28℃光照培養(yǎng)箱中催芽。待出芽后取出，將馬鈴薯切成留有一個芽眼的三角塊，選取芽長相近的薯塊置于濾紙上晾1 d（若馬鈴薯較小則直接栽種）。然后將薯塊芽眼朝上，播至混配蛭石和土壤（1∶1）的花盆中，于田間種植培養(yǎng)。

其中CK表示僅澆清水；SB表示鈴薯瘡痂病病原菌Streptomyces bottropensis發(fā)酵液；BM（單）表示拮抗菌Bacillus methylotrophicus發(fā)酵液一次澆灌；BM（雙）表示拮抗菌Bacillus methylotrophicus發(fā)酵液兩次澆灌。分別制備病原菌與拮抗菌的發(fā)酵液（108CFU/mL），在馬鈴薯新生薯塊剛剛形成時采取灌根法接種病原菌孢子懸液，每盆100 mL；在接種后的第7、14和21 d別接入100 mL拮抗菌的孢子懸液，并設僅澆灌清水對照、僅接種病原菌對照以及接種病原菌并澆灌LB液體培養(yǎng)基對照，每處理重復3次。

待馬鈴薯收獲后，進行病害分級鑒定，計算病情指數與防治效果。馬鈴薯瘡痂病分級標準及統計方法病害分級標準［11］為：0級，無病斑；1級，有病斑1%-5%；2級，有病斑5%-10%；3級，有病斑10%-20%；4級，有病斑20%-40%；5級，有病斑40%-60%；6級，病斑60%以上。發(fā)病率=發(fā)病粒數/收獲小薯粒數×100%，病情指數=∑（病級粒數×發(fā)病級別）/（收獲小薯粒數×最高級別）×100%，防治效果=（對照病情指數-處理病情指數）/照病情指數×100%［11］。使用R軟件對數據進行差異顯著性分析。

2 結果

2.1 拮抗菌發(fā)酵液對病原菌的拮抗效果

初篩得到15株拮抗效果較好的菌株，并從其中挑選了9株菌進行復篩試驗。復篩試驗中各菌株的發(fā)酵液液所產生的抑菌圈直徑如表1所示，說明各菌株的發(fā)酵液中可能含有多種抑菌活性物質，對馬鈴薯瘡痂病病原菌Streptomyces bottropensisAMCC400023均具有一定拮抗作用。其中菌株1-3-4的抑菌圈直徑為20.74 mm，對病原菌的拮抗能力最強（圖1）。

表1 各菌株發(fā)酵液產生的抑菌圈直徑

圖1 菌株1-3-4拮抗菌發(fā)酵液對病原菌的拮抗效果

2.2 菌株1-3-4的菌體形態(tài)觀察

經37℃培養(yǎng)24 h后，菌株1-3-4的菌落在LB培養(yǎng)基平板上呈圓形，乳白色，略有隆起，表面褶皺干燥，不透明，邊緣不整齊，革蘭氏染色呈陽性，菌體桿狀（圖2）。

圖2 菌株1-3-4在LB培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)（左）與革蘭氏染色實驗結果（右）

2.3 菌株1-3-4生理生化測定結果

菌株1-3-4的生理生化鑒定結果如表2所示。菌株1-3-4的接觸酶實驗反應呈陽性，V-P測定反應呈陰性，能夠分解利用檸檬酸鹽、阿拉伯糖、木糖，對2%、5%、7%和10%鹽濃度具有耐受性。

表2 菌株1-3-4的生理生化特性

2.4 菌株1-3-4 16S rDNA基因序列分析結果

以菌株1-3-4的DNA為模板，PCR擴增得到該菌株約1.4 kb的特異性片段。經測序后，用MEGA 7構建的系統發(fā)育樹如圖3所示。根據菌株1-3-4的16S rDNA基因序列分析結果，結合其培養(yǎng)形態(tài)特征和生理生化特性，將該菌株鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。

2.5 菌株1-3-4對馬鈴薯瘡痂病盆栽防效測定結果

通過溫室盆栽試驗測定了菌株1-3-4對馬鈴薯瘡痂病的防治效果。結果（圖4）顯示接種瘡痂病病原菌的薯塊發(fā)病情況較為嚴重，菌株1-3-4在盆栽試驗中防治效果約為40.27%與48.66%（表3），顯著降低了馬鈴薯瘡痂病的發(fā)病程度。說明菌株1-3-4對于馬鈴薯瘡痂病具有較好的防治作用。

圖3 基于菌株1-3-4 16S rDNA序列構建的系統發(fā)育樹

表3 菌株1-3-4對馬鈴薯瘡痂病的盆栽防治效果

圖4 馬鈴薯瘡痂病拮抗菌盆栽防效試驗

3 討論

馬鈴薯瘡痂病是一種較難防治的農業(yè)病害，隨著馬鈴薯種植的不斷推廣，其為農業(yè)生產帶來的危害也逐漸加重。傳統的應對方法是采用多種化學藥劑進行防治，但化學防治存在著誘發(fā)微生物抗藥性、毒害農作物、環(huán)境污染等問題［12］。而利用拮抗菌進行生物防治具有防病效果好、綠色無污染、對生態(tài)環(huán)境影響較小等優(yōu)點，正逐漸引起人們的重視。劉大群等［13］報道了利用拮抗鏈霉菌防治馬鈴薯瘡痂病的大田試驗研究，不同接種量和接種方法均顯著地影響防治效果。Hiltunen等［14］利用淀粉酶產色鏈霉菌（S. diastatochromogenes）PonSSII等非致病性鏈霉菌防治馬鈴薯瘡痂病，田間試驗結果表明防治效果較好。

國內外學者對針對馬鈴薯瘡痂病進行生物防治研究時采用的病原菌多為S. scabies、S. acidiscabies和S. turgidiscabies等菌株［11］，而對于Streptomyces bottropensis病原菌防治方面的報道較少。本研究以馬鈴薯瘡痂病病原菌Streptomyces bottropensisAMCC400023為靶標菌株，從山東省高密市馬鈴薯種植地采集的土壤中分離篩選得到了1株對馬鈴薯瘡痂病病原菌具有較強有拮抗作用的菌株1-3-4，其抑菌圈直徑達19.74 mm。根據該菌株的16S rDNA基因序列分析結果，結合其培養(yǎng)形態(tài)特征和生理生化特性，將其鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。

近年來關于該類菌株應用于植物病害生物防治的報道較多。劉利強等［17］通過田間藥效試驗確定了30億個/g甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌可濕性粉劑的對于防治黃瓜灰霉病的最佳使用劑量。謝學文等［18］從連作多年的黃瓜根際土樣中篩選得到1株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌WF-3，田間試驗表明其對黃瓜炭疽病具有良好的防治效果。周登博等［19］分離得到一株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌4-L-16，其對香蕉枯萎病在內的9種病原菌真菌具有廣譜抑菌活性。目前國內外還少有關于甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌用于防治馬鈴薯瘡痂病的報道。本研究拓展了甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的應用范圍，為新型微生物制劑的開發(fā)提供了良好資源。

為了初步探明該菌株對馬鈴薯瘡痂病的實際防治效果，進行了盆栽防效測定試驗，結果顯示菌株1-3-4可顯著降低馬鈴薯瘡痂病的發(fā)病程度，防治效果約為40.27%與48.66%，具有良好的應用前景。而該菌株在實際生物防治過程中的最佳施用方法、施用濃度、在土壤及馬鈴薯植株內的定殖情況以及對生態(tài)環(huán)境的影響等還需要進一步的研究以明確。

4 結論

以山東省高密市馬鈴薯種植地采集的土壤為研究對象，馬鈴薯瘡痂病病原菌Streptomyces bottropensisAMCC400023為靶標菌，篩選獲得較強有拮抗作用的菌種1-3-4，將其鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。盆栽防效測定試驗結果顯示，菌株1-3-4對于馬鈴薯瘡痂病具有較好的防治作用。