野大豆多功能根際促生菌的篩選鑒定和促生效果研究

郭英 楊萍 張丹雨 劉瑩瑩 馬蓮菊 卜寧

（沈陽師范大學生命科學學院，沈陽 110034）

植物根際促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，簡稱 PGPR）指自由生活于土壤或定植在植物體內具有固氮、解磷釋鉀、產生植物激素、分泌抗生素和促進植物生長的一類有益微生物［1］。自1978年Burr等首先在馬鈴薯上報道 PGPR以來，國內外學者對水稻、玉米、小麥、苜蓿、披堿草、杉木和馬尾松等植物的PGPR進行了廣泛深入的研究［2-4］，發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、沙雷氏菌屬（Serratia）、固氮菌屬（Azotobacter）、農桿菌屬（Agrobacterium）、產堿菌屬（Alcaligens）和伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）等20 多個種屬的根際微生物具有防病促生潛能，并對其固氮、溶磷、產生植物激素、抑病機理以及作為新型肥料的菌源在農業(yè)生產中的開發(fā)利用等方面進行了有益的探索［5］。

野大豆（Glycine soja）是一年生草本植物，為栽培大豆近緣祖先種，具有高蛋白、抗逆性強、繁殖系數大、適應性廣等優(yōu)點，因其為栽培大豆種質創(chuàng)制的重要物質基礎和栽培大豆生產可持續(xù)發(fā)展的重要戰(zhàn)略資源而成為研究的熱點［6-9］。自然環(huán)境條件下生長的野大豆植株不僅具有栽培大豆所不含的豐富遺傳物質和功能基因，而且其原始生境復雜，種群多樣性豐富，其根際促生菌的豐富度和多樣性都較其他物種更為優(yōu)越。對野大豆根瘤及根際土壤微生物進行篩選研究，極有可能挖掘到具有潛在應用價值的多功能根際促生菌株，但相關研究卻鮮有報道。本研究從野大豆根瘤和根際土壤中篩選出12株細菌，分別對其固氮基因、解磷、合成生長素能力、產ACC脫氨酶活性以及盆栽促生效果作用進行測定，旨在篩選優(yōu)質、獨特、高效的多功能根際促生菌，為野大豆根際促生菌種質資源的基礎研究和開發(fā)應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試根瘤和土樣 2016年9月采自于沈陽市沈北新區(qū)蒲河沿岸生長的健康野大豆（Glycine sojaSieb.et Zucc）根瘤和根際土。將采集樣品分別裝入無菌紙袋中，于24 h內分離，或于4℃冰箱保存，48 h內進行分離。

1.1.2 主要培養(yǎng)基及試劑 Hoagland營養(yǎng)液：取1.26 g Hoagland營養(yǎng)液（粉末）加入0.845 g硝酸鈣，定容至1 000 mL，115℃滅菌20 min。

Ashby培養(yǎng)基：甘露醇10 g，NaCl 0.2 g，MgSO40.2 g，CaCO31 g，CaSO40.2 g，K2HPO40.2 g，pH7.0-7.2。

蒙金娜無機磷（PKO）培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.003 g，MnSO4·4H2O 0.003 g，MgSO4· 7H2O 0.3 g，Ca3（PO4）25 g，pH7.2。

有機磷卵黃培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H20 0.03 g，MnS04·4H2O 0.03 g，蛋黃卵磷脂 0.2 g，CaCO35 g，酵母膏 0.4 g，瓊脂 18 g，pH 7.0-7.5。

King培養(yǎng)基（g/L）［10］：蛋白胨20.0 g，甘油15mL，K2HPO41.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，色氨酸 0.1 g，pH7.2（用KOH調pH）。

TSB液體培養(yǎng)基［11］：胰蛋白胨15 g，大豆蛋白胨 5 g，NaCl 5 g，H2O 1 000 mL，pH7.2。

DF 培養(yǎng)液 ：KH2PO44 g，Na2HPO46 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，葡萄糖 2 g，葡萄糖酸鈉 2 g，檸檬酸 2 g，（NH4）2SO42 g，組分 1和組分 2溶液各 0.1 mg。（組分 1：H3BO310 mg，MnSO4·H2O 11.19 mg，Zn SO4·7H2O 124.6 mg，CuSO4·5H2O 78.22 mg，MoO310 mg，溶于 100 mL 滅菌蒸餾水中，-4℃保存；組分2：FeSO4·7H2O 100 mg 溶于 10 mL 滅菌蒸餾水中，-4℃保存），H2O 1 000 mL，pH7.2。

ADF 培養(yǎng)基：以3 mmol/LACC代替DF中的（NH4）2SO4，為唯一氮源。

Spot比色液：吸取 0.5 mol/L FeCl31 m L溶于50 m L蒸餾水，加入濃 H2SO430 m L，冷卻后定容至100 mL。

S2比色液：準確稱取 FeCl34.5 g，溶于10.8 mol/L H2SO4中，冷卻后定容至 1 L。

1.2 方法

1.2.1 PGPR菌株的分離純化

1.2.1.1 根瘤菌的組織分離法 取新鮮、飽滿的野大豆根瘤用自來水洗凈，并用無菌紙吸干，無菌水沖洗3-4次，75%的酒精消毒，無菌水沖洗3-5次，無菌紙吸干備用。將根瘤用研缽加無菌水進行研磨，用涂布法將研磨后的少量根瘤組織液涂布于Ashby平板上，28℃培養(yǎng)，采用稀釋平板劃線法進行菌種純化，純化后的菌種接斜面，4℃保存?zhèn)溆?。吸取最后一次無菌洗滌水在Ashby平板上涂布，28℃培養(yǎng)，作為空白對照。

1.2.1.2 土壤根際菌的平板涂布法 取野大豆根際土壤10.0 g，放入帶玻璃珠并裝有90 mL 0.85%生理鹽水的250 mL三角瓶中充分振蕩30 min后靜置，取上清液稀釋涂布于Ashby平板，28℃培養(yǎng)，分別挑取形態(tài)不同菌落進行純化，純化后轉至斜面，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PGPR菌株的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學鑒定 于光鏡下觀察菌體細胞形態(tài)，如細胞形態(tài)大小、莢膜、鞭毛、芽孢等；將菌種涂布在Ashby平板上，25℃培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。

1.2.2.2 生理生化指標鑒定 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》的方法對分離得到的菌株進行部分生理生化鑒定。

1.2.2.3 分子生物學鑒定 采用菌落PCR方法擴增16S rDNA。擴增產物測序送由生物工程（上海）股份有限公司完成，通過NCBI數據庫在線比對測序結果，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 固氮酶nifH基因擴增 提取菌株基因組DNA作為PCR擴增模板，采用第一輪引物FGPH19：5′-TACGGCAARGGTGGNATHG-3′和POLR：5′-ATSGCCATCATYTCRCCGGA-3′擴 增nifH基 因 片段。 反 應 體 系：Premix Taq 25 μL（TaKaRa）， 引物（10 μmol/L）1 μL， 模 板 1 μL， 用 ddH2O 補 足50 μL。反應體系 ：Premix Taq 25 μL（TaKaRa），引物（10 μmol/L）1 μL， 模 板 1 μL， 用 ddH2O 補 足50 μL。反應程序：95℃預變性5 min；94℃變性1min，55℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，共 30個循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。第二輪引物：AQER：5′-GACGATGTAGATYTCCTG-3′和POLF：5′-TGCGAYCCSAARGCBGACTC-3′。

反應體系 ：Premix Taq 25 μL（TaKaRa），引物1 μL，模板1 μL第一輪擴增產物，充分混勻稍加離心。反應程序：95℃ 預變性5 min；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。擴增后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 菌株解磷能力測定

1.2.4.1 解有機磷測定（透明圈法）將待測菌點接至有機磷卵黃平板，每組5次重復，28℃培養(yǎng)14 d，測定解磷透明圈的直徑D與菌落直徑d，并計算其比值D/d。

1.2.4.2 解無機磷測定 采用鉬銻法測定可溶性磷標準曲線［12］。參照 Rodriguez和 Fraga的方法［13］。將待測菌接種于PKO培養(yǎng)基中，28℃，160 r/min培養(yǎng)7 d，8 000 r/min離心l5 min，取上清測定OD700值，計算溶磷量，每組5次重復。以不接菌的PKO培養(yǎng)基作為空白對照。

1.2.5 產激素能力測定

1.2.5.1 IAA測定 標準曲線的制作，分別測定各濃度3-吲哚乙酸標準液OD530值，繪制 IAA 標準曲線；將菌株培養(yǎng)液10 000 r/min，4℃離心10 min，取上清液5 mL加5 mL S2 比色液，在黑暗下靜置30 min后，迅速測定待測液的OD530值，并在標準曲線上查出待測液的IAA濃度［10］。

1.2.5.2 ACC 脫氨酶活性測定 繪制α-丁酮酸含量標準曲線；采用 Bradford法測定細胞提取液中的總蛋白含量，以牛血清白蛋白為標準蛋白。待平板長出單菌落后，挑取單菌落接種至DF和ADF培養(yǎng)液中，30℃，170 r/min培養(yǎng)24 h。酶活性的測定方法參見文獻［11］。ACC脫氨酶活力以反應體系中每毫克菌體蛋白每小時催化ACC生成α-丁酮酸的μmol量表示。酶活性測定設置空白對照。測定結果為3次重復值。

1.2.6 PGPR菌株的盆栽促生試驗

1.2.6.1 發(fā)酵液的制備和大豆種子催芽 將分離得到的純培養(yǎng)物分別接種到50 mL Ashby液體培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min發(fā)酵48 h，備用。取健康飽滿的大豆種子經75%酒精浸泡30 s，10% H2O2表面消毒，無菌水沖洗5-6次，將種子平鋪于濕潤的濾紙上，并用4層濕潤紗布覆蓋，28℃，催芽36-48 h，待胚根長至2 mm左右時備用。

1.2.6.2 實驗分組處理及大豆幼苗的培養(yǎng) 設實驗和對照兩組。以滅菌蛭石為栽培基質進行盆栽，將已催芽的大豆種子胚根向下栽種于花盆內，分別在各實驗組中的根際加入菌株1 mL發(fā)酵液，而對照組則加入不含菌的培養(yǎng)液，每組3個重復。在幼苗培養(yǎng)期間，適時補充Hoagland營養(yǎng)液，并不斷交換擺放位置，以保證每盆植物生長條件基本一致［14］。

1.2.6.3 促生指標的測定 隨機抽取處理后培養(yǎng)40 d的大豆幼苗，測量其莖長、根長。分離地上部分與地下部分，測量其莖鮮重、根鮮重，80℃烘干至恒重，分別測量莖干重、根干重。用SPSS和Excel軟件處理數據并分析。

2 結果

2.1 PGPR菌株的分離篩選

從野大豆根瘤及其根際土壤分離得到124株細菌，經進一步篩選，最終獲得12株固氮菌，其菌株編號分別為GD9、GD11、GD17、GD30、GD51、GD58、N1、N2、N3、N4、N5、P1。

2.2 PGPR菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學及生理生化指標鑒定 12株菌的形態(tài)學特征及部分生理生化指標的鑒定結果分別見表1、圖1和表2。

表1 12株野大豆PGPR菌株的形態(tài)學特征

2.2.2 分子生物學鑒定 對分離篩選得到的12個野大豆PGPR菌株的16S rDNA序列通過 NCBI數據庫完成BLAST比對，完成分子生物學鑒定。結果（表3）顯示，12株菌分別與其模式菌的基因同源相似度為99%或100%，分別歸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）、根瘤菌屬（Rhizobium）、詹森氏菌屬（Janthinobacterium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、根癌農桿菌屬（Agrobacterium）用MEGA6.0構建菌株的系統(tǒng)進化樹見圖2。

圖1 12株野大豆PGPR菌株的菌體形態(tài)

2.3 固氮酶nifH結構基因的擴增

采用Touch-Up PCR（上升PCR）的方法從分離篩選的12株野大豆PGPR菌株中擴增到目的條帶，nifH基因的PCR產物電泳圖見圖3。

2.4 野大豆PGPR菌株解磷能力

2.4.1 解有機磷能力 對12株野大豆PGPR菌的解有機磷實驗測定結果（圖4）表明，菌株GD9和P1具有解有機磷能力，可以在有機磷卵黃平板上形成透明圈，其2株菌的D/d值分別為2.14和1.42（表 4）。

2.4.2 解無機磷能力 12株野大豆PGPR菌的解無機磷測定結果（表4）表明，除菌株GD58外，其余11株菌均可解無機磷，其中P1菌株的解無機磷能力最強，達57.31 mg/L；解磷能力在30%左右的有7株。

表2 12株野大豆PGPR菌株的部分生理生化指標

表3 12株根瘤固氮菌株的16S rRNA比對結果

2.5 激素產生測定結果

2.5.1 產生IAA測定結果 對12株野大豆PGPR菌株的IAA測定結果（表5）表明，菌株GD17、GD58、N4均具有產生IAA能力，其中GD58菌株產 IAA 能力最強（71.05 μg/mL），其次是N4（8.46 μg/mL），GD17 最?。?.51 μg/mL）。

圖2 基于16S rDNA序列構建的12株野大豆PGPR菌株的系統(tǒng)進化樹

2.5.2 ACC脫氨酶活性測定結果 12株PGPR菌的ACC脫氨酶活性測定結果（表5）顯示，GD9、GD17、GD58、N4、P1菌 株 有 ACC酶 活 性， 但酶活性均不高，各菌株酶活力有一定差異，其中菌 株 GD17 酶 活 性 最 高［0.59 μmol/（mg·h）］， 其次 為 GD-58［0.283 μmol/（mg·h）］ 和 N4［0.334 μmol/（mg·h）］，分泌能力較弱的為 GD11［0.194 μmol/（mg·h）］和 P1［0.058 μmol/（mg·h）］。

圖3 nifH基因PCR擴增電泳圖

圖4 解有機磷菌株

表4 十二株野大豆PGPR菌的解磷結果

表5 十二株產激素測定結果

2.6 野大豆PGPR菌株對盆栽大豆促生影響

由表6可知，分別接種6株篩選出的PGPR菌處理組與對照處理相比，大豆幼苗的鮮重、干重、植株長檢測指標均優(yōu)于對照組，菌株GD11、GD17、GD58對大豆的整體鮮重、干重提高能力較強；6株菌中有GD17和GD58菌株可顯著提高幼苗的株高，菌株 GD58 提高能力最強；菌株GD9、GD11、GD17、GD30、GD58均可不同程度的提高大豆幼苗的根長。綜合以上指標可以看出，菌株GD17、GD58的促生效果最為明顯。

表6 六株野大豆PGPR菌株對盆栽大豆促生影響

3 討論

以往的大量研究表明植物根際促生菌以細菌分布最為廣泛，具體來說這類微生物通過生物固氮或者生物溶磷作用為植物提供氮素及磷素營養(yǎng)，有些還可分泌抗生素、植物激素等代謝產物以及產生鐵載體等。一直以來國內外研究學者致力于研究生物菌劑或微生物肥料，目的在于PGPR 在植物根際的有效定殖可調節(jié)植物根際微生態(tài)的變化，有益菌群在植物根際成功定殖，可形成優(yōu)勢菌落，促進作物生長［10］。目前，已在水稻［15］、玉米［16］、小麥［17］、馬鈴薯［18］、棉花［19］等重要糧棉作物，以及大豆［20］、花生［21］、豌豆［22］等豆科作物上成功應用。在不同生長條件下的植物，存在著許多與之相對應的對其生長有利的PGPR。韓麗珍等［23］從茶樹根際土壤中分離篩選出 6 株PGPR，有2株具有固氮能力，有1株菌株均具有產IAA能力，有4株具有ACC脫氨酶活性。代金霞等［24］從荒漠植物檸條分離產ACC 脫氨酶菌株 5 株，5 株菌株全部具有固氮、產IAA和產鐵載活性，但不同菌株間產生的量有一定的差異，菌株接種試驗表明，所分離根際促生菌菌株對檸條幼苗生長具有明顯的促進作用，尤其促進了根系的發(fā)育。

本試驗以大豆幼苗植株的株高、根長、地上部分干鮮重、地下部分干鮮重為依據討論了6株根際促生菌株代謝產物的促生活性，測量這些生長參數能夠直觀反應大豆幼苗的生長狀況。研究發(fā)現(xiàn)，經過菌株GD58、GD17菌株胞外發(fā)酵物處理的大豆幼苗生長狀況明顯優(yōu)于對照組［25］，說明GD58、GD17菌株對大豆幼苗具有一定的促生長作用。

研究菌株的生物學特性、功能特性、促生特性及相關機理，以期為研制微生物肥料收集優(yōu)良PGPR菌株資源，為可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略和生態(tài)環(huán)境的保護與建設探索一條生態(tài)、環(huán)保的建設道路奠定基礎［26-28］。

4 結論

本試驗從沈陽沈北新區(qū)蒲河沿岸生長的野大豆根瘤及根際土壤中分離篩選出12株PGPR菌，通過形態(tài)學特征和生理生化試驗及16S rRNA 序列對比鑒定分別歸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）、根瘤菌屬（Rhizobium）、詹森氏菌屬（Janthinobacterium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、根癌農桿菌屬（Agrobacterium）；其中 2株可解有機磷，11株可解無機磷，3株具分泌IAA能力，5株具ACC脫氨酶活性。大豆盆栽試驗表明：菌株GD17、GD58接種處理的植株幼苗鮮重、干重、株高均顯著高于未接種的對照，可見其能夠顯著促進大豆幼苗的生長。