環(huán)化熒光蛋白生物探針熒光壽命成像研究進(jìn)展

周加勝 王鵬 周黃梅 許金銘 張三軍

（1. 華東師范大學(xué)精密光譜科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200062；2. 華東師范大學(xué)物理與材料科學(xué)學(xué)院，上海 200241）

如今，熒光蛋白已經(jīng)被廣泛用于生命科學(xué)的研究中，而作為生物探針是它的一項(xiàng)重要應(yīng)用。通過(guò)基因編碼的熒光蛋白探針可以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物小分子的特異性檢測(cè)，以及實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生命過(guò)程，從而為病理研究、疾病早期發(fā)現(xiàn)提供一種強(qiáng)有力的工具。相比于化學(xué)染料探針，基因編碼的熒光蛋白探針生物兼容性更好，細(xì)胞毒性更小，同時(shí)在細(xì)胞內(nèi)的定位也更加準(zhǔn)確，一般不會(huì)損壞細(xì)胞，可以更好的減少人為因素的干擾。環(huán)化熒光蛋白探針是近些年來(lái)發(fā)展比較迅速的一類(lèi)生物探針，獨(dú)特的構(gòu)造方式使其更容易感受外界環(huán)境的變化，從而在生物檢測(cè)方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，引起了越來(lái)越多科學(xué)家的注意，現(xiàn)已發(fā)展成為一類(lèi)重要的熒光蛋白探針。但受制于生物活體內(nèi)的復(fù)雜性及目前檢測(cè)方法的局限性，還有環(huán)化熒光蛋白自身的原因，如亮度低、易受pH值影響、會(huì)被光漂白等原因，導(dǎo)致能夠真正用于科學(xué)研究的環(huán)化熒光蛋白探針并不多。本文主要從環(huán)化熒光蛋白發(fā)展，現(xiàn)階段的檢測(cè)方法，以及目前所存在的問(wèn)題這些方面進(jìn)行綜述，旨在為環(huán)化熒光蛋白探針的進(jìn)一步發(fā)展及應(yīng)用提供參考和幫助。

1 環(huán)化熒光蛋白探針發(fā)展?fàn)顩r

1.1 環(huán)化熒光蛋白的設(shè)計(jì)理念

對(duì)于綠色熒光蛋白而言，其由11條螺旋組成的桶和1條穿過(guò)桶中心的螺旋構(gòu)成，發(fā)色團(tuán)則為處于桶內(nèi)部65-67位的3個(gè)氨基酸殘基［1-2］。通常，由于單獨(dú)的發(fā)色團(tuán)會(huì)與周?chē)娜軇┫嗷プ饔?，以及自身的振?dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)，導(dǎo)致非輻射躍遷過(guò)程太強(qiáng)，所以是不發(fā)光的。而當(dāng)處于桶內(nèi)，由于限制了振動(dòng)與轉(zhuǎn)動(dòng)，減少了發(fā)色團(tuán)的非輻射躍遷而增強(qiáng)了輻射躍遷過(guò)程，從而產(chǎn)生熒光。對(duì)于其他顏色的熒光蛋白，其組成結(jié)構(gòu)與綠色熒光蛋白基本類(lèi)似。而熒光蛋白生物探針對(duì)物質(zhì)檢測(cè)的原理是探測(cè)物與熒光蛋白相互作用影響了發(fā)色團(tuán)的光物理性質(zhì)，從而根據(jù)光強(qiáng)或者其他信息的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)物濃度或者其他信息的標(biāo)定。

對(duì)于環(huán)化熒光蛋白探針而言，目前設(shè)計(jì)的基本原理是在原始熒光蛋白的合適位點(diǎn)打開(kāi)肽鏈，并在產(chǎn)生的初始N端和C端之間接上合適的肽鏈，就可以在發(fā)色團(tuán)的附近產(chǎn)生新的N端和C端。然后在新的N端和C端接上合適的、對(duì)某種探測(cè)物特異性響應(yīng)的結(jié)合域蛋白［4-5］，并通過(guò)多次篩選，從而得到所需的環(huán)化熒光蛋白探針（圖1）。當(dāng)結(jié)合域蛋白和探測(cè)物結(jié)合后會(huì)改變結(jié)合域蛋白的構(gòu)象結(jié)構(gòu)，從而影響熒光蛋白發(fā)色團(tuán)所處的微環(huán)境，進(jìn)而改變其發(fā)光特性，利用其光物理性質(zhì)的變化對(duì)探測(cè)物的濃度等信息進(jìn)行監(jiān)測(cè)。例如，基于環(huán)化熒光蛋白的HyPer系列氧化還原類(lèi)探針，依賴的原理就是H2O2進(jìn)入結(jié)合域蛋白的疏水腔從而改變疏水結(jié)構(gòu)，在殘基間形成二硫鍵使得結(jié)合域蛋白的構(gòu)象急劇變化，影響了熒光蛋白發(fā)色團(tuán)所處的微環(huán)境，導(dǎo)致光物理性質(zhì)發(fā)生改變（圖2），而后根據(jù)光譜的變化實(shí)現(xiàn)測(cè)量［6-9］。因?yàn)槎蜴I在一定條件下對(duì)氧化還原狀態(tài)比較敏感，所以Fan等［10］在2015年的報(bào)道中提出直接將二硫鍵插入到環(huán)化熒光蛋白的N端和C端之間，以此來(lái)檢測(cè)氧化還原狀態(tài)的改變?？梢?jiàn)，環(huán)化熒光蛋白探針并不一定需要具備結(jié)合域蛋白，重要的是在新產(chǎn)生N端和C端之間提供一個(gè)可以感受探測(cè)物的位點(diǎn)，這表明環(huán)化熒光蛋白的結(jié)合區(qū)域也可以由化學(xué)小分子或者其他物質(zhì)來(lái)充當(dāng)。

圖1 環(huán)化熒光蛋白構(gòu)建模型示意圖［3］

1.2 環(huán)化熒光蛋白生物探針的發(fā)展

自 從 1997年，Miyawaki和 Tsien 等［11］在Nature雜志上報(bào)道首個(gè)基于綠色熒光蛋白的Ca2+探針后，該課題組便不斷嘗試使用其他方法構(gòu)建新的Ca2+探針。1999年，Tsien和Baird等［4］使用環(huán)化青色熒光蛋白取代供體的原始青色熒光蛋白，試圖提高探針的動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍。盡管最后在加入飽和的Ca2+后強(qiáng)度比率變化僅為15%，但作者認(rèn)為這個(gè)結(jié)果并不能否定環(huán)化熒光蛋白在生物探針?lè)较虻臐摿?，也為環(huán)化熒光蛋白的設(shè)計(jì)打開(kāi)了大門(mén)。在此啟發(fā)下，Miyawaki課題組［12］在2001年報(bào)道了基于環(huán)化熒光蛋白開(kāi)發(fā)的第一種實(shí)用Ca2+探針，即Pericam。Pericam融合了攜鈣素（CaM）和目標(biāo)肽M13作為Ca2+響應(yīng)區(qū)域，在結(jié)合Ca2+之后，利用激發(fā)光譜中的峰值強(qiáng)度比例變化情況來(lái)檢測(cè)Ca2+濃度。在他們的工作中得到的一系類(lèi)變體均具有較大的動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍，并成功地實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)的Ca2+的檢測(cè)。之后，一系列的Ca2+環(huán)化熒光蛋白探針被開(kāi)發(fā)出來(lái)，并被用于多個(gè)方面［13-17］。表1列出了這些年來(lái)出現(xiàn)的大部分的基于環(huán)化熒光蛋白設(shè)計(jì)的生物探針。

圖2 HyPerRed檢測(cè)原理示意圖（根據(jù)文獻(xiàn)重新繪制［9］）

可以看出，近些年來(lái)基于環(huán)化熒光蛋白設(shè)計(jì)的生物探針越來(lái)越多。主要的使用范圍還是用于對(duì)細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的研究、細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的監(jiān)測(cè)以及藥物篩選等領(lǐng)域，對(duì)體外物質(zhì)的檢測(cè)比較少。而且，值得注意的是，對(duì)某一類(lèi)物質(zhì)特異性響應(yīng)的環(huán)化熒光蛋白探針的發(fā)展也是一個(gè)不斷改進(jìn)的過(guò)程。例如，第一代Hyper由環(huán)化黃色熒光蛋白和來(lái)自大腸桿菌中對(duì)H2O2敏感的結(jié)合域蛋白OxyR-RD組成，顯示出對(duì)H2O2亞微摩爾的親和力，但是動(dòng)態(tài)范圍只有3倍左右［6］。為解決第一代Hyper動(dòng)態(tài)范圍小的問(wèn)題，Hyper-2被研發(fā)出來(lái)，其動(dòng)態(tài)范圍達(dá)到6倍［7］。但是Hyper-2是強(qiáng)二聚體，導(dǎo)致其對(duì)氧化還原動(dòng)力學(xué)響應(yīng)較慢，無(wú)法實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。在此基礎(chǔ)之上，又開(kāi)發(fā)了第三代Hyper-3［8］，它對(duì)H2O2具有更快的響應(yīng)速率，而且動(dòng)態(tài)變化范圍和Hyper-2類(lèi)似。從上面表1中可以看出來(lái)，目前環(huán)化熒光蛋白探針的動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍還不是很大，普遍在10倍以內(nèi)，有的甚至變換不到2倍，如2016年在Science上報(bào)道的對(duì)NAD+檢測(cè)的環(huán)化熒光蛋白探針［33］。總的來(lái)說(shuō)，動(dòng)態(tài)范圍大、響應(yīng)快速的環(huán)化熒光蛋白探針是一個(gè)重要的發(fā)展方向。

2 環(huán)化熒光蛋白生物探針的檢測(cè)方法

目前環(huán)化熒光蛋白探針對(duì)物質(zhì)檢測(cè)時(shí)所使用的方法主要還是基于熒光強(qiáng)度和熒光比率這兩種。對(duì)于使用熒光強(qiáng)度方法的環(huán)化熒光蛋白探針，其穩(wěn)態(tài)熒光光譜一般只有單一的激發(fā)峰和發(fā)射峰。如對(duì)過(guò)氧硝酸鹽檢測(cè)的pnGFP［43］，通過(guò)探測(cè)加入探測(cè)物之后單個(gè)熒光通道的熒光強(qiáng)度變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)的定量測(cè)量。而使用熒光比率方法的環(huán)化熒光蛋白探針，其穩(wěn)態(tài)熒光光譜一般具有兩個(gè)激發(fā)峰，或者兩個(gè)發(fā)射峰，可進(jìn)一步分為激發(fā)比率型探針和發(fā)射比率型探針。如YCs系列環(huán)化熒光蛋白探針就是基于發(fā)射比率的方法對(duì)Ca2+進(jìn)行檢測(cè)，F(xiàn)lincGs探針則是基于激發(fā)比率來(lái)檢測(cè)cGMP［19，35］。無(wú)論激發(fā)比率型還是發(fā)射比率型環(huán)化熒光蛋白探針，都是通過(guò)測(cè)量?jī)蓚€(gè)波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度比值變化情況來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)探測(cè)物的定量檢測(cè)。由于兩個(gè)波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度來(lái)自同一蛋白，所以二者的比值跟環(huán)化熒光蛋白生物探針的濃度無(wú)關(guān)。最理想的情況是兩個(gè)波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度變化情況相反，從而熒光比值能夠更靈敏的檢測(cè)探測(cè)物的變化。總而言之，熒光比率的方法可以不受環(huán)化熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的影響，具備了可以直接檢測(cè)探測(cè)物絕對(duì)濃度的能力，同時(shí)又具有大的靈敏度。

從上面介紹中我們可以得知，能使用熒光比率方法的探針一般來(lái)說(shuō)都可以使用熒光強(qiáng)度的方法，但是對(duì)于只具有單一激發(fā)峰和發(fā)射峰的環(huán)化熒光蛋白探針一般只能使用熒光強(qiáng)度的方法。如果針對(duì)某一物質(zhì)為了實(shí)現(xiàn)比率型方法測(cè)量而重新設(shè)計(jì)一種全新的探針，勢(shì)必需要大量的工作。科學(xué)家們?yōu)榱私鉀Q這個(gè)問(wèn)題，通過(guò)在原有環(huán)化熒光蛋白探針上接上另一種不同顏色的熒光蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)比率測(cè)量的目的。由于兩種發(fā)光蛋白都是已知的，這樣一來(lái)也就減少了工作量。例如，Peredox是一種檢測(cè)還原型輔酶和其氧化物濃度比值的探針（NADH/NAD+），它只有單一的激發(fā)峰和發(fā)射峰［30］。Hung和Yellen等［30］通過(guò)在Peredox上連接紅色的熒光蛋白mCherry，來(lái)形成一種新的探針Peredox-mCherry。在使用過(guò)程中利用mCherry的熒光強(qiáng)度來(lái)標(biāo)定環(huán)化熒光蛋白探針在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的量，從而消除熒光強(qiáng)度型探針易受細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量影響的缺點(diǎn)，對(duì)NADH/NAD+比率的測(cè)量則還是利用新探針的內(nèi)部的Peredox。即使用mCherry熒光強(qiáng)度對(duì)Peredox的熒光強(qiáng)度幅值進(jìn)行修正，從而實(shí)現(xiàn)了比率測(cè)量的目的。但是作為一個(gè)有多個(gè)發(fā)色團(tuán)的環(huán)化熒光蛋白，Peredox-mCherry的分子量很大，容易引起蛋白聚集等效應(yīng)，影響探針的使用。而且，該探針中的綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的成熟和光漂白過(guò)程不同步，限制了該探針的性能。不過(guò)由于減少了工作量，這樣的方法也為環(huán)化熒光蛋白的設(shè)計(jì)提供了新的思路。

表1 環(huán)化熒光蛋白生物探針及特性

3 時(shí)間分辨熒光在環(huán)化熒光蛋白探針中的應(yīng)用

3.1 時(shí)間分辨熒光方法的優(yōu)勢(shì)

雖然相對(duì)于電化學(xué)等方法，熒光強(qiáng)度和熒光比率的檢測(cè)方式可以避免對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損害。但是這兩種方法都屬于穩(wěn)態(tài)熒光方法的范疇，本質(zhì)上還是基于熒光強(qiáng)度的測(cè)量來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目的。這就帶來(lái)了一個(gè)問(wèn)題，因?yàn)闇y(cè)量熒光強(qiáng)度的儀器設(shè)備在不同廠商制造時(shí)所使用的標(biāo)準(zhǔn)并不一樣，無(wú)論是穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀、酶標(biāo)儀，還是共聚焦顯微成像系統(tǒng)都有這個(gè)問(wèn)題，所以在用不同的設(shè)備對(duì)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)量時(shí)所得到的結(jié)果嚴(yán)格來(lái)說(shuō)并不能直接進(jìn)行比較。時(shí)間分辨熒光的方法為此提供一個(gè)解決途徑，它通過(guò)測(cè)量熒光壽命的變化來(lái)標(biāo)定分析物的濃度。一般來(lái)說(shuō)，環(huán)化熒光蛋白的熒光壽命會(huì)隨著探測(cè)物的加入而發(fā)生改變，通過(guò)測(cè)量熒光壽命的變化，從而可以得出探測(cè)物濃度等信息。相對(duì)于穩(wěn)態(tài)熒光方法，時(shí)間分辨熒光方法由于提供了一個(gè)通用的標(biāo)準(zhǔn)——“時(shí)間”，這就允許了在不同設(shè)備上測(cè)得的數(shù)據(jù)可以直接比較。同時(shí)熒光壽命反映的是環(huán)化熒光蛋白生物探針從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)的過(guò)程，在合理的濃度下，與熒光蛋白的數(shù)量無(wú)關(guān)。所以環(huán)化熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的數(shù)量并不影響其熒光壽命，具備了比率型方法不受發(fā)色團(tuán)濃度影響的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)有些熒光物質(zhì)由于光譜相似，使用穩(wěn)態(tài)的方法難以區(qū)分。如還原型輔酶NADH和NADPH，由于它們的光譜非常相似，如何利用光學(xué)的方法將它們區(qū)分曾一度困擾著科學(xué)家［52］。除了發(fā)展對(duì)它們各自特異性響應(yīng)的熒光探針外，2014年，Blacker等［53］使用時(shí)間分辨熒光技術(shù)，結(jié)合數(shù)學(xué)模型很好的解決了這個(gè)問(wèn)題。這顯示出時(shí)間分辨熒光方法在物質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，未來(lái)在環(huán)化熒光蛋白探針中也必將發(fā)揮更大的作用。

表2 環(huán)化熒光蛋白探針?lè)N類(lèi)的熒光壽命及測(cè)量環(huán)境

3.2 熒光壽命成像在環(huán)化熒光蛋白探針中的應(yīng)用

相比于熒光顯微鏡，基于熒光強(qiáng)度對(duì)生物組織進(jìn)行成像，也可以在此基礎(chǔ)上，基于時(shí)間分辨熒光的方法，利用熒光壽命大小對(duì)生物組織成像。通過(guò)不斷的激發(fā)和掃描樣品，再經(jīng)過(guò)分析得到每個(gè)像素點(diǎn)處的熒光壽命大小，進(jìn)而觀察生物組織不同位置的熒光壽命變化情況，以此來(lái)監(jiān)測(cè)探測(cè)物。即將體外一維的壽命信息，通過(guò)成像技術(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)槎S的圖像。通過(guò)我們的文獻(xiàn)調(diào)研，表2列出了目前已知的環(huán)化熒光蛋白探針在熒光壽命方面研究的結(jié)果。

從表2中可以看出目前熒光壽命成像（Fluorescence lifetime imaging microscopy，F(xiàn)LIM）技術(shù)在環(huán)化熒光蛋白探針上的應(yīng)用剛剛起步，近些年才開(kāi)始逐漸使用。而且大多數(shù)被用于還原型輔酶NAD（H）方面［31，33，54-57］，應(yīng)用的還不是十分廣泛，但已表明時(shí)間分辨熒光方法的優(yōu)勢(shì)。除了儀器比較昂貴以外，限制FLIM技術(shù)應(yīng)用的主要原因，在于環(huán)化熒光蛋白探針的平均熒光壽命在探測(cè)物濃度改變的時(shí)候變化并不明顯，通常只有不到1 ns的熒光壽命變化。甚至有的環(huán)化熒光蛋白探針熒光壽命幾乎不變化，如2016年報(bào)道的對(duì)NAD+檢測(cè)的環(huán)化熒光蛋白［33］。如此小的平均熒光壽命變化限制了探針對(duì)探測(cè)物響應(yīng)的動(dòng)態(tài)范圍，自然限制了這種方法在該類(lèi)探針上的使用。如果要解決這個(gè)問(wèn)題，一方面是要通過(guò)不斷的突變和篩選，得到熒光壽命變化更明顯的環(huán)化熒光蛋白探針；另一方面要不斷的研究環(huán)化熒光蛋白的發(fā)光機(jī)理，探究影響環(huán)化熒光蛋白熒光壽命變化的因素，從根本上解決目前環(huán)化熒光蛋白平均熒光壽命變化小的問(wèn)題，為以后的環(huán)化熒光蛋白的設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)。

圖3 部分強(qiáng)度比值方法原理示意圖［56］

在現(xiàn)有的條件下，也可以通過(guò)探索新的方法達(dá)到增大變化動(dòng)態(tài)范圍的目的。我們知道一般環(huán)化熒光蛋白探針的熒光衰減并不是按照單一指數(shù)衰減，而是有多個(gè)衰減成分。平均熒光壽命只是各組分壽命綜合作用的表現(xiàn)，并不代表每一組份壽命的變化情況，這也表明可以進(jìn)一步挖掘熒光壽命的信息進(jìn)行物質(zhì)檢測(cè)。2017年，Chang等［56］利用部分熒光強(qiáng)度比值的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)探測(cè)物濃度的表征，極大的擴(kuò)大了動(dòng)態(tài)范圍。其原理如圖3所示，通過(guò)對(duì)Peredox環(huán)化熒光蛋白探針在加入NADH前后的時(shí)間分辨熒光衰減曲線進(jìn)行擬合（圖3-A，3-B），拆分出τ1、τ2和τ3這3個(gè)熒光壽命組成成分以及它們各自所占的比重α1、α2和α3。在圖3-C，3-D中分別用綠藍(lán)紅這3種顏色來(lái)表示τ1、τ2和τ3，其中不同的直線斜率代表了不同的壽命大小，而熒光衰減曲線下不同顏色所占的面積則表示了不同組分對(duì)整體熒光強(qiáng)度所占的貢獻(xiàn)，它的大小跟部分強(qiáng)度相關(guān)?？梢钥闯觯尤隢ADH后部分強(qiáng)度α1τ1增大，而α2τ2減小，利用它們比值 α1τ1/α2τ2的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)探測(cè)物濃度的定量測(cè)量（圖3-E）。這種方法可以極大的擴(kuò)展動(dòng)態(tài)范圍，即使像Frex這種平均熒光壽命變化動(dòng)態(tài)范圍變化只有1.09倍左右的環(huán)化熒光蛋白探針，在此方法的處理下，也可以得到了4倍多的動(dòng)態(tài)范圍［56］。而且對(duì)于Peredox這種只有單一激發(fā)峰和發(fā)射峰的環(huán)化熒光蛋白探針，利用此方法同時(shí)實(shí)現(xiàn)了比率測(cè)量，無(wú)需在其上面接上新的熒光蛋白，這是在穩(wěn)態(tài)熒光方法中目前還實(shí)現(xiàn)不了的。隨著環(huán)化熒光蛋白探針的研究越來(lái)越深入，時(shí)間分辨熒光這種方法會(huì)發(fā)揮出越來(lái)越重要的作用。

4 現(xiàn)階段的問(wèn)題

無(wú)論是使用哪種方法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，前提條件還是環(huán)化熒光蛋白探針的性質(zhì)要優(yōu)良。值得注意的是，目前大多數(shù)的環(huán)化熒光蛋白熒光探針都會(huì)或多或少受pH值的影響。主要的原因是pH值會(huì)影響處于質(zhì)子型和離子型狀態(tài)的環(huán)化熒光蛋白比例，從而干擾對(duì)探測(cè)物濃度的測(cè)量?，F(xiàn)在消除pH影響可以通過(guò)努力篩選出一種對(duì)pH值不敏感的熒光蛋白探針，這需要極大的工作量，如Peredox經(jīng)過(guò)大量的定點(diǎn)突變消除了探針的pH敏感性［30］。更普遍的方法是利用額外的熒光蛋白對(duì)pH的影響進(jìn)行校準(zhǔn)和修正，如 SoNar和 FHisJ［32，51］。而且目前大多數(shù)的環(huán)化熒光蛋白探針都是基于黃色或者綠色熒光蛋白設(shè)計(jì)的（表1），這些短波長(zhǎng)的熒光在生物組織內(nèi)部的散射性太大，導(dǎo)致成像深度不深，而且對(duì)細(xì)胞的光毒性也比較大。而環(huán)化紅色熒光蛋白探針由于突變的困難，目前還沒(méi)有被廣泛的開(kāi)發(fā)出來(lái)。相比于化學(xué)染料探針，目前的環(huán)化熒光蛋白探針的動(dòng)態(tài)范圍還比較小，這也是普遍存在的一個(gè)問(wèn)題。同時(shí)，現(xiàn)階段的使用的探測(cè)方法還比較單一，時(shí)間分辨熒光的還沒(méi)有被普遍使用。同時(shí)值得注意的是，拋開(kāi)環(huán)化熒光蛋白探針自身性質(zhì)的因素，F(xiàn)LIM這種基于時(shí)間分辨熒光的技術(shù)也有其自身的缺點(diǎn)。因?yàn)镕LIM得到的是一個(gè)二維圖像，其圖像上的每個(gè)像素點(diǎn)都代表著一條時(shí)間分辨熒光衰減曲線。在我們的實(shí)驗(yàn)中，每一幅圖有6萬(wàn)多個(gè)像素點(diǎn)，這也就是6萬(wàn)多條時(shí)間分辨熒光衰減曲線。而且，每條曲線如果要得到準(zhǔn)確的擬合，就要保證在每個(gè)像素點(diǎn)有足夠多的光子數(shù)被記錄。同時(shí)為了保證單光子探測(cè)的效果，光子計(jì)數(shù)率不能太大。這些原因會(huì)導(dǎo)致為了得到一副準(zhǔn)確的熒光壽命圖像需要測(cè)量大量的時(shí)間。一般發(fā)光強(qiáng)度比較弱的環(huán)化熒光蛋白并不適合使用FLIM技術(shù)，因?yàn)闀?huì)導(dǎo)致細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間處于在光照下，從而產(chǎn)生光漂白以及損害細(xì)胞活性等問(wèn)題。同時(shí)，開(kāi)發(fā)出一個(gè)新的熒光探針的工作量仍然很大，科學(xué)家們?cè)谶^(guò)去十幾年間也對(duì)設(shè)計(jì)環(huán)化熒光蛋白的方法進(jìn)行不斷的研究［21，58-59］。例如，2017 年，Wongso 等［59］報(bào)道了一種基于環(huán)化熒光蛋白設(shè)計(jì)生物探針的新方法，并把這類(lèi)探針?lè)Q為Flashbody。這類(lèi)探針采用抗體作為結(jié)合域蛋白，通過(guò)優(yōu)化熒光蛋白與抗體的連接方式產(chǎn)生最佳的效果。相比于從天然蛋白質(zhì)中篩選結(jié)合域蛋白這種費(fèi)時(shí)費(fèi)力的方法，使用抗體充當(dāng)結(jié)合域蛋白則會(huì)使探針的開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單得多，在某些方面會(huì)極大的減少工作量，也會(huì)減少開(kāi)發(fā)的盲目性。Ast等［21］也報(bào)道了一種基于環(huán)化熒光蛋白設(shè)計(jì)生物探針的通用開(kāi)發(fā)平臺(tái)。它采用俄羅斯套娃的模式，將兩個(gè)熒光蛋白進(jìn)行嵌套，然后將其插入在結(jié)合域蛋白的合適位置。其中一個(gè)熒光蛋白用來(lái)修正非探測(cè)物因素對(duì)熒光探針的影響，另一個(gè)蛋白則用來(lái)對(duì)探測(cè)物進(jìn)行響應(yīng)，利用二者的熒光強(qiáng)度比值來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)探測(cè)物的準(zhǔn)確測(cè)量。可以看出，目前的環(huán)化熒光蛋白的一大研究方向就是盡量減少開(kāi)發(fā)的工作量，使開(kāi)發(fā)流程能夠簡(jiǎn)單化，同時(shí)又要保證熒光探針能實(shí)現(xiàn)對(duì)探測(cè)物的準(zhǔn)確測(cè)量。

5 結(jié)語(yǔ)

本文回顧了這些年來(lái)環(huán)化熒光蛋白探針的發(fā)展?fàn)顩r，比較了幾種探測(cè)方法的優(yōu)劣，以及環(huán)化熒光蛋白目前存在的問(wèn)題。總體上說(shuō)，環(huán)化熒光蛋白探針正在越來(lái)越多的被科學(xué)家注意到，更多的環(huán)化熒光蛋白探針也被愈加廣泛的被應(yīng)用在生命科學(xué)領(lǐng)域去解決不同的問(wèn)題。雖然目前還存在著諸多問(wèn)題，但是隨著對(duì)環(huán)化熒光蛋白研究的不斷深入，以及設(shè)計(jì)方法不斷的完善，動(dòng)態(tài)范圍更大、特異性更好、響應(yīng)速度更快、亮度更強(qiáng)、抗漂白性更好、pH值耐受性更強(qiáng)、發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的環(huán)化熒光蛋白生物探針也必定會(huì)被陸續(xù)被開(kāi)發(fā)出來(lái)。在探測(cè)的方法上，也會(huì)隨著對(duì)這類(lèi)蛋白機(jī)理研究的更加深入，不斷的發(fā)展新的探測(cè)和分析方法。同時(shí)隨著學(xué)科之間融合的更加密切，環(huán)化熒光蛋白也必將會(huì)在生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。