淡紫擬青霉次級代謝產(chǎn)物的研究進展

郝澤婷 郝曉慧 閻婧 謝丙炎 梁麗琴

（1. 山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨汾041004；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜與花卉研究所，北京100081）

淡紫擬青霉是子囊菌門、肉座菌目、蛇形蟲草科、Purpureocillium屬的一種絲狀真菌，分布范圍廣，可從線蟲、土壤、腐爛的植物、昆蟲、人類和空氣中分離到，是一種寄主范圍較廣的真菌［1］。淡紫擬青霉對人類具有致病作用，可感染人類導(dǎo)致角膜發(fā)炎。但對植物寄生線蟲、蚜蟲［2］、紅蜘蛛［3］、溫室粉虱和切葉蟻［4］等都有很好的防治作用。除此之外，淡紫擬青霉對多種植物病原細菌、真菌和病毒也有抑制作用。淡紫擬青霉QLP12對真菌菌絲生長，尤其是梨形毛霉、粉紅單端胞霉、立枯絲核菌和黃萎病菌有較強的抑制作用。淡紫擬青霉能夠減少侵染大豆根部的鐮刀菌、菜豆殼球孢菌和立枯絲核菌，但是對于這些菌的抗性卻隨著時間而降低。由此可見，淡紫擬青霉為一種廣譜性很強的生防菌，展開對淡紫擬青霉生物防治機制的研究有利于改善食品安全、提高糧食產(chǎn)量、保護生態(tài)環(huán)境和保持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

淡紫擬青霉能寄生于線蟲卵，孫漫紅等［5-6］發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉可以抑制大豆胞囊2齡線蟲對大豆根部的趨化性，且其發(fā)酵液對大豆胞囊2齡線蟲有很好的抑殺作用。淡紫擬青霉能夠分泌幾丁質(zhì)酶和絲氨酸蛋白酶，從而降解線蟲表皮的幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)成分，利于侵入并破壞細胞成分。同時，研究發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶有助于根結(jié)線蟲卵的孵化，其濃度越高孵化率越高，而且對根結(jié)線蟲幼蟲有毒殺作用［7］；也能內(nèi)生于植物，產(chǎn)生效應(yīng)物對其它真菌產(chǎn)生拮抗作用；也能定殖于植物根際，產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物，對真菌、線蟲等產(chǎn)生抑殺作用。但當前對淡紫擬青霉與植物的直接作用研究得較少。2006年，李芳等［8］研究發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉產(chǎn)生的存在于胞外和胞內(nèi)的次級代謝產(chǎn)物對尖孢鐮刀菌的孢子萌發(fā)有抑制作用；2015年，楊婷等［9］發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉產(chǎn)生的胞外蛋白有類似于生長素的作用，對植物有高濃度抑制低濃度促進作用；2017年，胡海巖等［10］發(fā)現(xiàn)紅樹林淡紫擬青霉產(chǎn)生的胞外多糖在一定濃度下可抑制皰疹I(lǐng)型病毒吸附到非洲綠猴腎細胞，并抑制皰疹I(lǐng)型病毒的生物合成，同年11月發(fā)現(xiàn)紅樹林淡紫擬青霉產(chǎn)生的胞外多糖可以刺激小鼠骨髓源性樹突細胞分化成熟［11］。由此可知，淡紫擬青霉產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物在防治病害、促進植物生長和醫(yī)學(xué)方面都有重要意義，因此，淡紫擬青霉的代謝產(chǎn)物研究越來越受到科研工作者的關(guān)注。

次級代謝產(chǎn)物在植物與微生物的某一生長期產(chǎn)生，是一類生長繁殖非必需的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的小分子物質(zhì)，如色素、激素、毒素和抗生素等。真菌是產(chǎn)生有活性次級代謝產(chǎn)物的重要生物，不同種類的真菌所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物不同。真菌次級代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)已成為新藥的重要來源［12］。對于次級代謝產(chǎn)物合成與調(diào)控的研究，有助于開發(fā)新的活性化合物，并提高活性化合物的產(chǎn)量。真菌常見的次級代謝產(chǎn)物有聚酮類、非核糖體肽類、甾醇、生物堿和萜類化合物等多種。淡紫擬青霉目前已發(fā)現(xiàn)的次級代謝產(chǎn)物有以下幾種（表1）。

本文綜述了淡紫擬青霉次級代謝產(chǎn)物的研究進展，討論了淡紫擬青霉次級代謝產(chǎn)物的研究意義。最后展望了淡紫擬青霉的研究前景，以期為相關(guān)研究者了解淡紫擬青霉提供參考。

1 淡紫擬青霉基于基因組的次級代謝產(chǎn)物的預(yù)測

2015年，Prasad等［13］利用Illumina Hiseq技術(shù)對淡紫擬青霉TERIBC 1菌株進行測序，基因組大小為40.02 Mb，運用SMURF預(yù)測了30個次級代謝產(chǎn)物合成基因：12個聚酮化合物合成酶（Polyketide synthase，PKS）、2個PKS-like、7個非核糖體肽合成 酶（Non-ribosomal peptide synthetases，NRPS）、7個NRPS-like、1個PKS-NRPS、1個二甲基丙烯基色氨酸合成酶（Dimethylally tryptophan synthases，DMATS）基因。2017年，王剛等［14］利用Illumina Hiseq技術(shù)對淡紫擬青霉PLBJ-1和PLFJ-1菌株進行測序，兩個菌株的基因組大小分別為38.14 Mb和38.53 Mb。用SMURF和antiSMASH軟件預(yù)測次級代謝產(chǎn)物合成基因簇，比較發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉PLBJ-1和PLFJ-1菌株編碼次級代謝產(chǎn)物基因的數(shù)量和種類相似，都編碼了13個PKS、2個PKS-like、10個NRPS、10個NRPS-like和1個PKS-NRPS、4個（Terpene synthase，TS）和1個DMATS基因。由此可以看出，淡紫擬青霉在次級代謝產(chǎn)物合成方面有很大的挖掘潛力。

表1 淡紫擬青霉次級代謝產(chǎn)物

2 非核糖體肽化合物

非核糖體肽類化合物由非核糖體肽合成酶（NRPS）催化合成，組成非核糖體肽的氨基酸包括蛋白氨基酸和非蛋白氨基酸。每個NRPS可劃分為一個或多個模塊（Module），每個模塊含有多個結(jié)構(gòu)域，其中有3個結(jié)構(gòu)域是必不可少的，包括：具有腺苷?；饔茫ˋdenylation，A）的結(jié)構(gòu)域，其作用是激活特異的氨基酸；硫醇化作用（Thiolation，T）或者肽基載體蛋白（Peptidyl carrier protein，PCP）結(jié)構(gòu)域，其作用是轉(zhuǎn)運肽鏈；縮合（Condensation，C）結(jié)構(gòu)域，其作用是催化氨基酸形成肽鍵［15］。1973年，Arai等［16］首次發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉能產(chǎn)生一種抗生素白灰制菌素（Leucinostatins），它是一種非核糖體肽類化合物，對腫瘤細胞、真菌和革蘭氏陽性菌有抑殺作用，且對兔子血壓有一定的降壓作用，但對腎上腺素和乙酰膽堿反應(yīng)沒有影響。從P.lilacinusA257、P.marquandi和Acremoniumsp.中也可以 分離到Leucinostatin［17］，它們結(jié)構(gòu)相似，只在少數(shù)幾個氨基酸位點上有差異。2004年，Park等［18］研究了淡紫擬青霉不同菌株Leucinostatins的產(chǎn)生和其活性作用發(fā)現(xiàn)，LS91、LS92和LS103菌株也能產(chǎn)生Leucinostatins產(chǎn)物，且對線蟲都有毒殺作用。淡紫擬青霉對線蟲的防治是否與Leucinostatin有關(guān)，Leucinostatin在防治過程中具體有何作用，這些問題到目前為止仍然是個未解之謎。2017年，王剛等［14］對淡紫擬青霉進行了全基因組測序和分析，對預(yù)測出的NRPS合成基因酶基因lcsA、PKS合成酶（LcsC）、Acyl-CoA連接酶（LcsD）和硫酯酶（LcsE）分別進行同源敲除，對野生型淡紫擬青霉和突變型淡紫擬青霉的發(fā)酵液粗提物進行高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）比較發(fā)現(xiàn)，突變體△LcsA、△LcsC、△LcsD和△LcsE的發(fā)酵液粗提物都缺少Leucinostatins A和Leucinostatins B，隨后在Leucinostatin的合成途徑發(fā)現(xiàn)這些酶起到了關(guān)鍵性作用，對淡紫擬青霉的Leucinostatins合成途徑做了推理。又進一步用淡紫擬青霉與辣椒疫霉病菌和馬鈴薯晚疫病菌分別對峙培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉對它們的生長都有抑制作用，并且在涂滿馬鈴薯晚疫病菌的平板上放置牛津杯，往各個牛津杯中加入Leucinostatin A和B混合物，發(fā)現(xiàn)有抑菌圈，說明淡紫擬青霉對辣椒疫霉病菌和馬鈴薯晚疫病菌的菌絲生長的抑制作用是由于代謝產(chǎn)生了Leucinostatins而起作用。但由于目前發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉只對G418有較弱的敏感性導(dǎo)致有很多假陽性轉(zhuǎn)化子，所以建立一個新的有多個抗性標記篩選體系或開發(fā)淡紫擬青霉的營養(yǎng)缺陷型菌株很有必要。Ishiyama等［19］發(fā)現(xiàn)Leucinostatin A和B對引起非洲人類錐蟲病的錐形蟲有很好的抑制作用，錐形蟲ATP合成酶的不完整會減慢細胞生長，而Leucinostatin A和B是線粒體解偶聯(lián)劑、ATP合成的抑制劑，同時Leucinostatin A是離子載體，可以破壞寄生蟲體內(nèi)平衡，因此對錐形蟲有很好的抑制作用。腫瘤細胞總是被基質(zhì)細胞圍繞著，并不單獨存在，Leucinostatin A是腫瘤-基質(zhì)細胞互作的調(diào)節(jié)子。2008年，對前列腺DU-145癌細胞與前列腺基質(zhì)細胞共培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，Leucinostatin A對前列腺癌細胞有更好的抑制作用比前列腺DU-145癌細胞單獨存在時［20］。但當時對Leucinostatin A的抑制機理并不明白，2010年，Kawada等［21］通過RT-PCR揭示了Leucinostatin A是通過減少前列腺基質(zhì)細胞中胰島素生長因子類似物來抑制前列腺DU-145癌細胞生長。但前列腺癌細胞的生長是否受Leucinostatin A濃度影響，在體內(nèi)使用時Leucinostatin A的濃度應(yīng)保持在何范圍，這些問題仍值得研究。2017年9月，Abe等［22］通過非對稱全合成Leucinostatin A，并結(jié)合核磁共振數(shù)據(jù)、高效液相色譜和生物活性分析表明Leucinostatin A的正確結(jié)構(gòu)是之前已經(jīng)報道結(jié)構(gòu)的差向異構(gòu)體。Leucinostatin A的結(jié)構(gòu)是當下一個頗具爭議的焦點（圖1）。

圖1 Leucinostatins的分子結(jié)構(gòu)

3 聚酮類化合物

聚酮化合物（Polyketide）是一種常見的次級代謝產(chǎn)物，它通過乙酸、丙二酸或丁酸等脫羧縮合而成，其PKS的合成機制和脂肪酸合酶相似。常見的聚酮化合物有具有降膽固醇作用的洛伐他丁，具有抗真菌作用的兩性霉素與灰黃霉素，具有抗細菌作用的紅霉素和四環(huán)素以及具有免疫抑制作用的雷帕霉素等。PKS可分為3類：I型PKS為模塊型，是由線性排列并且共價結(jié)合的幾個功能結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的酶，任何功能結(jié)構(gòu)域在鏈的合成延伸過程中非重復(fù)使用，主要合成聚醚類、多烯類和大環(huán)內(nèi)酯類聚酮化合物。II型PKS為芳香族型，起始單位均為乙酰CoA，以丙二酰輔酶A為延伸單位合成具有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的聚酮類化合物。III型PKS為查爾酮合成酶類，為一類能夠重復(fù)利用的同源二聚體酶，催化泛酰輔酶A間的縮合，合成一環(huán)或者多環(huán)類芳香聚酮化合物［23］。Acremoxanthone C 和 Acremonidin A是淡紫擬青霉產(chǎn)生的聚酮化合物類次級代謝產(chǎn)物，是氧雜蒽酮-蒽醌異二聚體，屬鈣調(diào)蛋白抑制劑，Acremoxanthone C是由非還原型聚酮化合物合成酶（NR-PKS）合成，已通過生物信息學(xué)預(yù)測出4個淡紫擬青霉Acremoxanthone C的候選合成基因簇。Acremoxanthone C與鈣調(diào)蛋白的親和性很高，Acremoxanthone C和Acremonidin A與典型的鈣調(diào)蛋白抑制子CPZ相比，它的結(jié)合位點不同于常見的典型抑制子，但和KAR-2與鈣調(diào)蛋白的結(jié)合位點相似［24］（圖2）。鈣調(diào)蛋白與不同的靶細胞相互作用，調(diào)節(jié)鈣離子依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路，包括基因調(diào)控、蛋白質(zhì)合成、離子通道功能、細胞運動、細胞器、趨藥性和平滑肌肉收縮。這種有新穎結(jié)合模型的鈣調(diào)蛋白抑制劑的發(fā)現(xiàn)可能導(dǎo)致新的研究工具的發(fā)現(xiàn)，且利于新藥的發(fā)現(xiàn)。2015年，Melendez-Gonzalez等［25］從Acremonium camptosporum中分離到一種新的Acremoxanthone類似物、Acremoxanthone C、Acremonidins A和 B、 以 及 Acremoxanthones A和B六種化合物，它們對卵菌P. aphanidermatum、P. cinnamomi、P. capsici、P. parasitica均 有 抑 制作 用。Isaka等［26］發(fā) 現(xiàn)Acremoniumsp.產(chǎn) 生 的Acremoxanthones A有抗金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌活性，Acremoxanthones B有抗白色念珠菌活 性。Intaraudom 等［27］發(fā) 現(xiàn)Verticilliumsp.產(chǎn) 生的Acremoxanthones F、G有抗蠟樣芽孢桿菌的活性、對癌細胞和非癌細胞有低毒性和抗惡性瘧原蟲K1的活性；Acremoxanthones A和B有抗金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌活性。而淡紫擬青霉產(chǎn)生的Acremoxanthone C是否具有抗細菌和真菌活性，與植物信號通路到底有何關(guān)系仍不清楚。

圖2 Acremoxanthone C和Acremonidin A的分子結(jié)構(gòu)［24］

4 生物堿

生物堿多指生物體內(nèi)含復(fù)雜氮環(huán)的堿性化合物，有明顯的生理效應(yīng)。Teles等［28］在淡紫擬青霉的生長期間添加有活性的鼠傷寒沙門氏菌、經(jīng)微波爐照射的鼠傷寒沙門氏菌和經(jīng)高壓滅菌失活的鼠傷寒沙門氏菌1 mL或10 mL，以不添加鼠傷寒沙門氏菌為對照，比較發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌的大量添加產(chǎn)生的提取物失活，鼠傷寒沙門氏菌的小量添加可以產(chǎn)生有活性的提取物，且淡紫擬青霉與少量經(jīng)高壓滅菌失活的鼠傷寒沙門氏菌共培養(yǎng)時產(chǎn)生的提取物對乙酰膽堿酯酶的抑制率最高。核磁共振技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)分析該提取物，得知添加1 mL經(jīng)高壓滅菌失活的鼠傷寒沙門氏菌可誘導(dǎo)淡紫擬青霉產(chǎn)生一種新的化合物Paecilomide，它是乙酰膽堿酯酶抑制劑，屬于吡啶酮生物堿（圖3）。乙酰膽堿為大腦神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，它的減少可引起老年癡呆癥，乙酰膽堿酯酶可作用于突出間隙，使乙酰膽堿減少，而乙酰膽堿酯酶抑制劑則有利于大腦中乙酰膽堿的積聚，能提高認知能力，改善行為和功能障礙，對老年癡呆癥的治療是有效的［29-31］。

圖3 Paecilomide的分子結(jié)構(gòu)［28］

5 淡紫擬青霉其他次級代謝產(chǎn)物

2013年，崔香等［32］采用活性跟蹤方法和各種色譜技術(shù)從深海淡紫擬青霉ZBY-1分離出具有抑制人癌細胞HL-60、K562、BGC-823、MCF-7生長的過氧化麥角甾醇、9（11）-去氫過氧化麥角甾醇、（22E，24R）-5α、6α-環(huán)氧 -3β-羥基麥角甾 -22-烯 -7-酮，還有腦苷脂A、B、C、D。同年，該團隊再次從該菌株分離到paecilaminol、paecilaminol鹽酸鹽、油酸、亞油酸、3-吲哚甲酸、3-吲哚甲醛、1（2）-linolyl-2（1）-palmityl-glycero-O-4′-（N，N，N-trimethyl）homoserine、對羥基苯甲酸、1，2-dilinolylglycero-O-4′-（N，N，N-trimethyl）homoserine、肉豆蔻酸甲酯、亞油酸甲酯等化合物，paecilaminol對豬腎上皮PK（15）細胞和大鼠肝腫瘤H4IIE-W細胞有細胞毒活性，paecilaminol和paecilaminol鹽酸鹽對人癌細胞HL-60、K562、BGC-823、MCF-7 都有抑制作用［33］。李小龍等［34］從淡紫擬青霉518菌株中分離到麥角甾醇、麥角甾 -7、22（E）-二烯 -3β、5α、6β-三醇（又稱酵母甾醇）、D-甘露糖醇和白僵菌素等，但其活性作用仍值得進一步研究。

6 展望

綜上所述，淡紫擬青霉寄主范圍廣泛，對植物寄生線蟲、蚜蟲［2］、紅蜘蛛［3］、溫室粉虱、切葉蟻［4］及植物病原真菌、細菌、病毒均具有很好的抑制作用，其產(chǎn)生的次級代謝物對治療老年癡呆及防治植物病害均有顯著作用，因而展開對淡紫擬青霉次級代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)、功能及合成途徑的研究對生物醫(yī)藥及農(nóng)業(yè)病害防治均具有重要意義。長期以來，由于真菌中多數(shù)基因簇在常見培養(yǎng)基中培養(yǎng)時表現(xiàn)出的基因沉默或表達量很低，導(dǎo)致真菌次級代謝物的研究受到一定阻礙，對淡紫擬青霉次級代謝產(chǎn)物的相關(guān)研究僅有Leucinostatins、Acremoxanthone Che Paecilomide三種，且它們的合成途徑及調(diào)控機制仍不明確。因而需要利用超表達轉(zhuǎn)錄因子，用可誘導(dǎo)強啟動子替換合成基因簇內(nèi)啟動子，對組蛋白修飾，對基因簇進行異源表達等方法激活沉默基因簇進一步發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎、有生物活性的次級代謝產(chǎn)物；需要通過改變培養(yǎng)條件來提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量；需要采用基因敲除的方法進一步明確次級代謝產(chǎn)物的合成機制。此外，需要不斷提高化學(xué)物質(zhì)分離檢測的效率與精度，才能更加有利于次級代謝產(chǎn)物的分離與結(jié)構(gòu)功能的鑒定。