楊凌區(qū)紫花苜蓿葉枯病病原分離鑒定及其生物學(xué)特性

梁嘉俊， 李芳紅， 高鴻鵬， 趙文睿， 焦 鋒

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 陜西 楊凌712100)

苜蓿(MedicagoSativa)是世界上種植面積最廣、最重要的一種多年生豆科牧草，其具有粗蛋白含量高，產(chǎn)量高的特點(diǎn)，有“牧草之王”之稱[1]。隨著苜蓿種植面積的進(jìn)一步擴(kuò)大，苜蓿病害逐漸成為影響苜蓿產(chǎn)量、品質(zhì)、限制苜蓿廣泛應(yīng)用的主要因素。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界每年因牧草病蟲(chóng)害造成的牧草生產(chǎn)損失高達(dá)35%以上，其中由病害造成的苜蓿減產(chǎn)就在20%以上，病害嚴(yán)重情況下甚至?xí)⒄麎K苜蓿地全部毀壞[2]。

立枯絲核菌是一種世界性廣泛傳播，屬無(wú)孢科(Agonomycetaceae)、絲核菌屬(Rhizoctonia)半知菌真菌，引起寄主植物葉枯和根腐等癥狀，被認(rèn)為是最具破壞力的植物病原菌之一[3]。立枯絲核菌可引起根腐、莖腐、立枯及葉枯病害的植物包括馬鈴薯(Solanumtuberosum)[4]、水稻(Oryzasativa)[5]、玉米(Zeamays)、沙打旺(Astragalusadsurgen)[6]等。李克梅[7]在新疆苜蓿立枯絲核菌根腐病調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，幾乎南北疆各苜蓿種植區(qū)都有此病害發(fā)生；郭玉霞[8]在豫中平原紫花苜蓿病原真菌調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，春、夏、秋3個(gè)季節(jié)立枯絲核菌均有發(fā)生；陳雅君[9]在黑龍江紫花苜蓿種植區(qū)的8個(gè)地市縣病害調(diào)查，致病菌的優(yōu)勢(shì)種為鐮刀菌、絲核菌。

由于立枯絲核菌不產(chǎn)生孢子，通常以菌絲融合反應(yīng)對(duì)其進(jìn)行融合群(anastomosis group，AG)的劃分[10]。但是使用融合群對(duì)立枯絲核菌進(jìn)行鑒定需要大量標(biāo)準(zhǔn)菌株，多數(shù)研究者不具備如此條件，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，逐步形成一套從基因水平上分析各微生物種之間親緣關(guān)系的分類鑒定技術(shù)與方法，且相較于傳統(tǒng)方法更為快速、準(zhǔn)確[11]。核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)有非常豐富的遺傳變異，常用來(lái)研究真菌物種分類鑒定[12]。例如，淮穩(wěn)霞[13]使用rDNA-ITS序列分析方法鑒定坪褐斑立枯絲核病菌的融合群類型并探討其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；苗國(guó)輝[14]采用形態(tài)特征觀察、致病性測(cè)定及rDNA-ITS序列分析方法鑒定出天津、黑龍江兩地大白菜褐斑病病原菌為立枯絲核菌。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)紫花苜蓿立枯絲核菌病害的研究主要集中在新疆苜蓿根腐病方面[7,15-16]，陜西苜蓿種植區(qū)未見(jiàn)立枯絲核菌為致病菌的報(bào)道，本試驗(yàn)對(duì)苜蓿葉枯病的病原菌進(jìn)行鑒定，同時(shí)對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以期為該病害的發(fā)生、防治提供理論支持。

基于機(jī)械創(chuàng)新設(shè)計(jì)大賽的卓越工程師培養(yǎng)模式是一種全新工程師培養(yǎng)模式的探索，它基于大學(xué)生機(jī)械創(chuàng)新設(shè)計(jì)大賽這個(gè)學(xué)科競(jìng)賽，其目的不僅僅局限于只是比賽，而是要以賽促教、以賽促學(xué)。在這種培養(yǎng)模式中，卓越工程師是培養(yǎng)的目的、方向，學(xué)科競(jìng)賽是途徑與方法，兩者互為動(dòng)力，缺一不可。概括起來(lái)有以下幾方面：

1 材料與方法

1.1 病樣采集及病原菌分離純化

2017年7月于陜西省楊凌區(qū)采集紫花苜蓿葉枯病樣本。按照常規(guī)組織分離法[17]分離培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)出后根據(jù)菌落特征分離純化，單一菌株再接入PDA培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，并移入PDA斜面培養(yǎng)基4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

由于乙二醇機(jī)組的溫度控制存在較大的非線性、參數(shù)時(shí)變性和模型不確定性等因素，普通PID控制器難以獲得很好的控制效果，所以決定采用模糊PID控制來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。

1.2 病菌形態(tài)及顯微觀察

假設(shè)在我國(guó)上市公司治理中，存在利益相關(guān)者甲和利益相關(guān)者乙，關(guān)于甲和乙誠(chéng)信問(wèn)題的囚徒困境博弈如圖3所示。

[論文集] 序號(hào) 作者.題名[C]//編著者.論文集名.出版地：出版者，出版年：起止頁(yè)碼.[學(xué)位論文] 序號(hào) 作者．題名[D].保存地點(diǎn)：保存單位，年份：起止頁(yè)碼.

技術(shù)應(yīng)用的轉(zhuǎn)型升級(jí)。以人工智能統(tǒng)領(lǐng)各項(xiàng)技術(shù)創(chuàng)新，大數(shù)據(jù)是人工智能的基石，AR出版、VR出版是知識(shí)服務(wù)的創(chuàng)新形態(tài)，知識(shí)圖譜與知識(shí)計(jì)算引擎是知識(shí)服務(wù)的核心構(gòu)成，智能閱讀機(jī)器人、智能科普機(jī)器人是服務(wù)機(jī)器人與新聞出版業(yè)結(jié)合的重要突破口。將大數(shù)據(jù)、增強(qiáng)現(xiàn)實(shí)、虛擬仿真、知識(shí)服務(wù)、人工智能、區(qū)塊鏈等技術(shù)原理學(xué)懂、弄通，并將之應(yīng)用在新聞出版產(chǎn)業(yè)鏈的各環(huán)節(jié)，加速這些高新技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)程，切實(shí)做到技術(shù)賦能出版、出版與科技融合。

1.3 菌株基因組DNA提取及ITS序列PCR擴(kuò)增

先在9.5 cm規(guī)格培養(yǎng)皿中放入兩層濾紙，0.5%吐溫-20處理后用脫脂棉包裹葉柄保濕，選取苜蓿植株上長(zhǎng)勢(shì)良好無(wú)創(chuàng)傷的相鄰三個(gè)復(fù)葉為一個(gè)接種處理，每個(gè)培養(yǎng)皿中放入3片苜蓿復(fù)葉。用打孔器分別取若干3 mm菌餅，每個(gè)單葉上放1個(gè)菌餅，重復(fù)數(shù)為5，加入無(wú)菌水覆蓋培養(yǎng)皿底部。同時(shí)設(shè)空白無(wú)菌餅為對(duì)照，接種2 d后從葉片上取走菌餅，防止葉片細(xì)胞呼吸受阻死亡而使葉片變黃影響觀察，一周后觀察葉片發(fā)病情況并拍照統(tǒng)計(jì)。

1.4 病原菌ITS序列分析

測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析，然后使用MEGA7.0軟件進(jìn)行序列間對(duì)比分析，構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)，分析各菌株間同源性。

將菌株接于PDA平板于25℃黑暗培養(yǎng)一周后，觀察并記錄菌落特征；光學(xué)顯微鏡觀察并記錄菌絲結(jié)構(gòu)、分支和隔膜的有無(wú)等顯微形態(tài)特征，根據(jù)真菌分類系統(tǒng)初步進(jìn)行種類鑒定。

1.5 菌株致病性試驗(yàn)

1.5.1離體葉片致病性測(cè)定 接種對(duì)象選用在溫室培養(yǎng)一月后無(wú)病的阿爾岡金紫花苜蓿(MedicagosativaL.‘Algonquin’)的葉片，接種前，先用自來(lái)水沖葉片表面，然后用0.5%的吐溫-20完全浸泡葉片5～10 s至葉片表面無(wú)氣泡。接種方法采用菌餅法接種(菌餅直徑約3 mm)，并分別設(shè)空白對(duì)照。

按照劉麗[18]的方法提取待測(cè)菌株DNA。采用真菌rDNA-ITS基因通用引物ITS1：5′-TCCGTA-GGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[19]。PCR擴(kuò)增體系：2×Taq PCR MaterMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL(對(duì)照加1 μL雙蒸水)，最后用雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。ITS基因PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)以后，委托西安擎科澤西生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，并將測(cè)得序列提交Genbank注冊(cè)登記。

1.5.2活體接種致病性測(cè)定 將阿爾岡金紫花苜蓿種子用70%乙醇表面消毒5 min，無(wú)菌水沖洗3次，晾干后播種于裝有滅菌基質(zhì)土的直徑12 cm塑料花盆中，每盆播種15粒種子，置于25℃、相對(duì)濕度60%、光照16 h、黑暗8 h人工氣候箱中培養(yǎng)。

用Mega7.0 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，采用K2模型，分別用鄰接法(NJ)構(gòu)建rDNA-ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖4)。

1.6 病原菌的生物學(xué)特性

1.6.1不同光照處理對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 將供試菌株接種于PDA平板培養(yǎng)基活化培養(yǎng)后，選取單菌落用以滅菌的打孔器從菌落邊緣切取4 mm直徑的菌餅，接種至新鮮的PDA平板中央，各處理重復(fù)3個(gè)培養(yǎng)皿。并分別放置于全黑暗、全光照、12 h光暗交替三種光照條件下，25 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后，用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測(cè)量菌落的生長(zhǎng)直徑。

1.6.2不同碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 以Czapek培養(yǎng)基[17]作為基本培養(yǎng)基，并分別用相同質(zhì)量的果糖、葡萄糖、淀粉代替培養(yǎng)液中的蔗糖作為不同碳源，最后在每升培養(yǎng)液中加入17 g瓊脂配制成含不同碳源的培養(yǎng)基，并以不加碳源、補(bǔ)加2 g·L-1NaCl的培養(yǎng)基作為對(duì)照；將4 mm直徑的病原菌菌餅接入各培養(yǎng)基平板中央，各處理重復(fù)3個(gè)培養(yǎng)皿。25 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，按照1.6.1方法測(cè)定。

1.6.3不同氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)影響 以Czapek培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，分別以相同質(zhì)量的硝酸鉀、硝酸銨、硝酸鈉和牛肉膏代替培養(yǎng)基中的NaNO3，同時(shí)以不加氮源、補(bǔ)加2 g·L-1NaCl的培養(yǎng)基作為對(duì)照；取直徑為4 mm菌餅置于各培養(yǎng)基中央，各處理重復(fù)3個(gè)培養(yǎng)皿。置于25 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后，按照1.6.1方法測(cè)定。

1.6.4不同pH值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 以濃度為0.1 M的NaOH與0.1 M的HCl將加熱融解完全后的PDA培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)至5.0，6.0，7.0，8.0，9.0共5個(gè)梯度，高溫滅菌后倒入培養(yǎng)皿，并將直徑為4 mm的菌餅接入不同pH值的PDA平板中央，各處理重復(fù)3個(gè)培養(yǎng)皿。25 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后，按照1.6.1方法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿葉枯病癥狀

該病原真菌生長(zhǎng)迅速，在PDA培養(yǎng)基上25℃ 培養(yǎng)3天可長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿,菌落呈白色至淺褐色平鋪于培養(yǎng)基上。菌絲絨毛狀,呈放射分布。菌落中央產(chǎn)生白色至褐色菌核，背面呈深褐色(圖2A，B)。顯微形態(tài)：菌絲體較粗大，初為無(wú)色，后呈淡黃褐色至褐色，直徑7～10 μm，分支呈直角，分支處縊縮，附近形成隔膜(圖2 C，D)。

圖1 紫花苜蓿葉枯病發(fā)病癥狀Fig.1 The symptoms of Medicago sativa leaf blight disease

2.2 病原菌菌落及顯微鏡照片

發(fā)病初期葉面出現(xiàn)形狀不規(guī)則的褐色病斑，病斑邊緣葉面枯黃，逐漸擴(kuò)大，病組織呈水漬狀崩解腐爛。死亡組織呈深褐色至黑色，葉面干枯皺縮(圖1A，B)。

測(cè)序結(jié)果分析表明其序列總長(zhǎng)度為573 bp，G+C含量為55.67%，將序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，得GenBank登錄號(hào)為：MH014991，病原菌序列與GenBank中已有的序列進(jìn)行核酸BLAST比對(duì)分析，得到與Genebank中已有序列同源性較高的菌種信息，選取立枯絲核菌不同融合群的模式菌株用于系統(tǒng)發(fā)育分析(表1)。

圖2 紫花苜蓿葉枯病病原形態(tài)特征Fig.2 The pathogen morphological characteristics of alfalfa leaf blight disease

2.3 分子生物學(xué)鑒定

將所提取出的病原菌DNA作為模板，用真菌ITS通用引物ITS1/ITS4做PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)5 μL點(diǎn)樣電泳后進(jìn)行EB染色，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下拍照如圖，條帶單一較亮，且無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶，分子量在500～750 bp之間(圖3)。

根據(jù)以上對(duì)病根癥狀及病原菌形態(tài)學(xué)的觀察，參考《真菌分類鑒定手冊(cè)》[20]，鑒定病原菌屬半知菌亞門(mén)，無(wú)孢目，絲核菌屬(Rhizoctonia.)。

接種液配制：接種菌株于PDA平板兩周后，刮取菌絲，使用0.5%吐溫-20無(wú)菌水配制成0.01 g·ml-1接種液。選取培養(yǎng)30d后長(zhǎng)勢(shì)相同的苜蓿植株，使用噴霧器將接種液平均噴施于健康苜蓿植株上，對(duì)照組接種0.5%吐溫-20無(wú)菌水，之后正常溫室管理，2周后觀察發(fā)病狀況并記錄拍照。

圖3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 The agarose gel electrophoresis of DNA products amplified by PCRM：DL2000 DNA marker；1：樣本泳道Sample；CK：陰性對(duì)照Negative control

分析rDNA-ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分支上側(cè)數(shù)字為大于50%的Bootstrap檢驗(yàn)值(1000次重復(fù))，結(jié)果表明：在遺傳距離為0.05，Bootstrap為1 000次檢驗(yàn)時(shí)，病原菌rDNA-ITS序列seq與R.solaniAG1，IA(AB000017.1)序列的置信度為98，說(shuō)明本試驗(yàn)研究的苜蓿葉枯病病原菌為立枯絲核菌(R.solani)AG1，IA融合群。

表1 用于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析的相關(guān)菌株Table1 Related strains usedn phylogenetic analysis

圖4 基于rDNA-ITS序列的NJ樹(shù)Fig.4 The NJ tree of rDNA-ITS sequence

2.4 致病性測(cè)定

2.4.1病原菌離體葉片接種 接種2 d后開(kāi)始出現(xiàn)明顯癥狀(圖5A)，接種葉片上具有不規(guī)則的褐色病斑，斑點(diǎn)周?chē)猩僭S退綠現(xiàn)象，接種一周后(圖5B，C)，病斑大面積存在于葉面。發(fā)病癥狀與田間發(fā)病癥狀相似，而對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)任何發(fā)病現(xiàn)象。通過(guò)統(tǒng)計(jì)菌餅接種法接種的27片復(fù)葉，浸染成功葉片數(shù)為17，發(fā)病率為62.96%。

2.4.2活體接種法 采用孢子懸浮液對(duì)健康的紫花苜蓿植株進(jìn)行活體接種2周后進(jìn)行病情統(tǒng)計(jì)：根部的側(cè)根褐化、腐爛，部分根毛脫落(圖6A)，葉部出現(xiàn)大小不等的深褐色病斑，病斑邊緣枯黃，部分葉片直接褪綠變黃(圖6B)。發(fā)病癥狀于田間采樣的病株癥狀基本相同，本試驗(yàn)所分離的菌株亦可引起苜蓿植株根部病變，而對(duì)照組則沒(méi)有任何發(fā)病現(xiàn)象(圖6C)。

綜上對(duì)病原菌致病性的試驗(yàn)結(jié)果，并分別對(duì)離體葉片接種和活體接種處理組發(fā)病葉片進(jìn)行病原菌分離、純化培養(yǎng)，得到與原接種所用相同病原菌，分離率為100%。根據(jù)科赫氏法則，可說(shuō)明本試驗(yàn)研究的病原菌是具有致病性的立枯絲核菌(R.solani)。

2.5 病原真菌的生物學(xué)特性研究

2.5.1不同光照條件對(duì)病原真菌菌絲生長(zhǎng)的影響 不同光照條件下對(duì)立枯絲核菌的菌絲生長(zhǎng)稍有差異,黑暗條件下菌絲生長(zhǎng)優(yōu)于其他條件，但與光暗交替條件下菌絲的生長(zhǎng)差異不顯著(表2)。

圖5 菌餅法離體葉片接種結(jié)果Fig.5 The results of inoculated with fungal block

圖6 紫花苜?；铙w接種后發(fā)病情況Fig.6 The incidence of Alfalfa after inoculation in vivo

表2 光照對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響Table 2 The effect of light on the growth of pathogenic

注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。同列數(shù)據(jù)后相同字母表示經(jīng)LSD法檢驗(yàn)P=0.05水平差異不顯著

Note:Values represent the means±SD of three replicates. The same letters in the same row are not significant different according to the least significant difference test (P=0.05)

2.5.2不同pH對(duì)病原真菌菌絲生長(zhǎng)的影響 pH對(duì)于立枯絲核菌的菌絲生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，pH在6.0～9.0時(shí)，菌株菌絲生長(zhǎng)均表現(xiàn)良好，無(wú)顯著差異(P<0.05)，但在pH值為7時(shí)，菌絲生長(zhǎng)最優(yōu)(圖7)。

圖7 pH對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響Fig.7 The effect of pH on the growth of the pathogen

2.5.3不同碳源對(duì)病原真菌菌絲生長(zhǎng)的影響 供試病原菌對(duì)供試碳源的利用情況存在一定的差異，但在不同碳源及無(wú)碳對(duì)照組CK中均能生長(zhǎng)。立枯絲核菌菌絲在含可溶性淀粉的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，在含果糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最差，且差異性顯著。在其他3種不同碳源培養(yǎng)基中，立枯絲核菌菌絲的生長(zhǎng)差異明顯，表現(xiàn)為蔗糖>葡萄糖>果糖。在無(wú)碳對(duì)照CK培養(yǎng)基上，菌絲生長(zhǎng)最慢且極其稀疏，不利于病原菌的生長(zhǎng)(表4)。

基于雙語(yǔ)平行語(yǔ)料庫(kù)的翻譯研究在國(guó)內(nèi)取得了一些成果(柯飛，2003，2005；秦洪武，2005，2009；徐欣，2010)，為后人研究提供了一套較為成熟的研究思路和方法。本研究通過(guò)運(yùn)用自建的漢英多譯本平行語(yǔ)料庫(kù)對(duì)同一篇中文小說(shuō)的五位不同英譯者的翻譯文本進(jìn)行對(duì)比分析，定量反映不同譯者文本的詞匯密度/豐富度、用詞偏好、句法特征等，揭示譯文的獨(dú)特性和共同特征。

表4 不同碳源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響Table 4 The effect of different C-source on growth of pathogenic

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

Note:Different letters in same row indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

2.5.3不同氮源對(duì)病原真菌菌絲生長(zhǎng)的影響 立枯絲核菌在不同氮源培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)具有顯著差異(P<0.05)。立枯絲核菌在不同氮源的培養(yǎng)基及無(wú)氮對(duì)照培養(yǎng)基(CK)中均能生長(zhǎng)并產(chǎn)生氣生菌絲，但不添加氮源時(shí)菌絲十分稀疏。相比之下，氮源為硝酸鉀最利于立枯絲核菌的生長(zhǎng)，其次是硝酸鈉與牛肉膏，而硝酸銨對(duì)立枯絲核菌生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最小，但這四種氮源對(duì)于立枯絲核菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性均沒(méi)有特別明顯的影響(表5)。

3 討論

通過(guò)對(duì)陜西省楊凌區(qū)紫花苜蓿葉枯病田間調(diào)查、病樣采集、病原菌室內(nèi)分離鑒定、致病性測(cè)定，確定了導(dǎo)致楊凌地區(qū)紫花苜蓿葉枯病的致病菌為立枯絲核菌，通過(guò)rDNA-ITS序列分析確定了紫花苜蓿葉枯病病原菌為AG1，IA融合群，GenBank登錄號(hào)為：MH014991。

表5 不同氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響Table 5 The effect of different C-source on growth of the pathogen

有研究指出立枯絲核菌中AG1類群可引起多種植物地上部分及葉脈的枯萎；AG2引起十字花科作物的根腐；AG4引起豆科作物的根腐[21]。在以往的研究中，立枯絲核菌主要是引起紫花苜蓿根腐病的重要病原菌[7-9,15]，李克梅[7]指出新疆苜蓿立枯絲核菌菌絲融合群有AG1，AG2，AG4，AG5 4種類型，其中AG2和AG4是優(yōu)勢(shì)融合群，與本試驗(yàn)從葉部病樣分離鑒定的立枯絲核菌菌絲融合群AG1,IA有所差異，雖然在活體致病性測(cè)定中，本試驗(yàn)分離的菌株也表現(xiàn)對(duì)苜蓿根部侵染的能力(圖6A)。立枯絲核菌作為一種寄主范圍較為廣泛的致病菌，在不同地域情況下，對(duì)相同寄主寄生的立枯絲核菌類群表現(xiàn)出一定的地域特異性。伍恩宇[22]報(bào)道陜西周至馬鈴薯立枯絲核菌菌絲融合群有AG-4，AG-5兩種類型；陜西草坪草立枯絲核菌菌絲融合群有AG1-1A，AF1-1B，AG2-2ⅢB，AG2-2Ⅳ，AG5 5種類型[23]。陜西苜蓿立枯絲核菌菌絲融合群與陜西其他植物各有差異，說(shuō)明菌絲融合群對(duì)寄主植物種類具有一定的選擇性。

苜蓿葉枯病菌在pH值為5.0～9.0的范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好，以pH值為7.0最適合生長(zhǎng)，說(shuō)明酸性環(huán)境下不利于該菌生長(zhǎng)，這與臺(tái)蓮梅[24]的研究馬鈴薯立枯絲核菌最適pH值為7.0的結(jié)果一致，與路小琴[25]報(bào)道馬鈴薯立枯絲核菌在pH值為6.0的固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快有所差異；黑暗培養(yǎng)對(duì)苜蓿葉枯病菌菌絲生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，與劉志恒[26]研究發(fā)現(xiàn)黑暗條件有利于白菜葉腐病病原菌(Rhizoctoniasolani)菌絲生長(zhǎng)相同；在不同碳源、氮源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況差異明顯，其中可溶性淀粉和硝酸鉀對(duì)菌絲生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用，與白菜葉腐病病原菌[26]、石竹莖腐病病原菌[27]最適碳源相似，但與上述兩種立枯絲核菌最適氮源有所差異，這可能是分離的菌屬于不同的菌絲融合群，生物學(xué)特性有一定的差異。根據(jù)病菌不喜酸性的特點(diǎn)，可采用石膏或酸性肥料等方法調(diào)節(jié)土壤酸堿度，抑制土壤中病菌的生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)較為系統(tǒng)的分析了陜西省苜蓿葉枯病致病菌及其生物學(xué)特性，與以往報(bào)道立枯絲核菌引起苜蓿根腐病[7-9]不同，本試驗(yàn)明確了立枯絲核菌亦是苜蓿葉枯病致病菌，同時(shí)也是陜西省首次報(bào)道立枯絲核菌引起苜蓿葉枯病。苜蓿葉枯病原菌生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)該菌最適pH值為7.0；黑暗條件下有利于該菌生長(zhǎng)；對(duì)碳源的利用效果中以可溶性淀粉最好，而對(duì)果糖利用效果最差；最適氮源為硝酸鉀，而對(duì)硝酸銨利用效果最差。