8份云南苜蓿屬優(yōu)異種質(zhì)資源對(duì)鋁脅迫的生理耐受響應(yīng)研究

孫文君， 唐 敏， 任 健， 許 喆， 姜 娜， 馬向麗*， 畢玉芬*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 云南 昆明650201； 2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院， 云南 昆明650201)

鋁是地殼中含量最豐富的金屬元素，占地殼質(zhì)量的7%左右[1]。在自然條件下主要以鋁硅酸鹽或氧化鋁形式存在[2]，生物可利用性很??；當(dāng)土壤pH值低于5時(shí)，高活性鋁[Al3+、Al(OH)2+和Al(OH)3+]的含量增加，會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育造成較大威脅，鋁毒已成為酸性土壤中植物生長(zhǎng)和發(fā)育最重要的限制因素[3-5]。自20世紀(jì)70年代起，植物耐鋁毒機(jī)制就倍受關(guān)注，現(xiàn)如今在酸性土壤中鋁毒對(duì)植物的影響已成為一個(gè)世界性的問(wèn)題[6]。大量研究表明，植物根尖是對(duì)鋁積累和鋁毒最敏感的部位[7-8]。植物遭受鋁毒害時(shí)，根系最先受到毒害[9-11]。

苜蓿(Medicagosativa)是豆科苜蓿屬深根性多年生豆科牧草[12]，是世界上栽培最早、面積最大、經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的牧草，也是改良土壤、保持水土的重要植物，有“牧草之王”的美稱[13]。苜蓿適宜生長(zhǎng)在pH值為6.7～7.5的土壤環(huán)境中，土壤pH值低于6.7時(shí)，苜蓿產(chǎn)量會(huì)隨著pH值下降而迅速下降[14]；我國(guó)長(zhǎng)江以南熱帶和亞熱帶地區(qū)，屬酸性土壤，紅黃壤土地占地面積很大，具有脫硅富鋁化的成土過(guò)程[15]，從而造成鋁毒害增強(qiáng)[12]。由于紫花苜?？顾徜X能力較差，在我國(guó)南方的種植倍受限制[16]。如何提高苜蓿在酸性土壤中的產(chǎn)量，一直是國(guó)內(nèi)外苜蓿工作者關(guān)注的重點(diǎn)。但是缺乏特異性抗酸鋁能力強(qiáng)的材料，且人們對(duì)苜蓿的抗酸鋁調(diào)節(jié)機(jī)制仍不完全清楚，導(dǎo)致抗酸鋁型苜蓿育種進(jìn)展緩慢[17]。

云南有野生苜蓿資源4種，即天藍(lán)苜蓿(M.lupulinaL.)、毛苜蓿(M.edgeworthiiSirj. ex Hand. Mazz.)、南苜蓿(M.polymorphaL.)和紫花苜蓿(M.sativaL.)[18]。此外，還存在大量的逸生苜蓿材料。云南80年代開(kāi)始試種苜蓿，但由于土壤和立體氣候等因素，至今尚未篩選出適宜大面積栽培和利用的品種。但期間卻保留少數(shù)個(gè)體逸生(逸散)于云南各地，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇和自然歸化，恢復(fù)到在沒(méi)有人工管理的野生狀態(tài)下，自己能年復(fù)一年繁衍生存下去，這些逸生苜蓿資源通常都是零星分布于草地上、草山草坡、農(nóng)田邊或林緣，形成了一些具有特異耐酸鋁性的苜蓿種質(zhì)資源，極具研究?jī)r(jià)值和育種前景[18]。然而，目前對(duì)云南野生和逸生苜蓿資料耐鋁性差異的報(bào)道較少。本研究探討了鋁脅迫下8份云南苜蓿屬種質(zhì)材料根尖各項(xiàng)生理指標(biāo)的變化，并采用隸屬函數(shù)分析法對(duì)8份苜蓿材料的耐鋁性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，以期為苜蓿在南方的推廣利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

項(xiàng)目組前期在云南省各地進(jìn)行了苜蓿屬資源調(diào)查，收集到云南野生和逸生苜蓿屬種質(zhì)資源30份，保存在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)實(shí)習(xí)基地。通過(guò)栽種和生產(chǎn)性能評(píng)價(jià)，篩選出生長(zhǎng)良好、且采集地pH值、生態(tài)環(huán)境差異較大的8份材料(表1)，進(jìn)行了繁殖收種，用于耐鋁性鑒定。

表1 8份云南野生和逸生苜蓿材料的采集地點(diǎn)Table 1 The collection site of 8 wild and escaped alfalfa in Yunnan

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在人工智能溫室中，采用12孔育苗盤(pán)珍珠巖育苗。待發(fā)芽后澆Hoagland完全營(yíng)養(yǎng)液培育10 d后測(cè)株高、根長(zhǎng)，并開(kāi)始進(jìn)行鋁脅迫處理(將營(yíng)養(yǎng)液的pH調(diào)整為4.5，脅迫濃度梯度為0,50,100,200,500 μmol·L-1)。試驗(yàn)期間每3 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液，脅迫處理時(shí)間10 d。

鋁脅迫處理后，測(cè)定各材料的根長(zhǎng)、株高及各項(xiàng)生理指標(biāo)。

1.3 測(cè)定方法

采用直尺分別測(cè)量供試材料脅迫處理前、后的株高和根長(zhǎng)，并計(jì)算株高、根長(zhǎng)抑制率，公式如下：

相對(duì)抑制率=(對(duì)照-脅迫處理)/對(duì)照×100%。

根系活力采用TTC比色法進(jìn)行測(cè)定[19]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[17]測(cè)定；過(guò)氧化物酶(POD)活性和超氧化物歧化酶(SOD)活性參照孫群(2006)[20]的方法測(cè)定；耐鋁毒脅迫能力評(píng)價(jià)采用模糊數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)值的方法進(jìn)行抗逆性綜合評(píng)定[21]：

隸屬函數(shù)值的換算方法：

A：R(Xij)=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

B：R(Xij)=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

C：R(Xi)=xij/n

式中：R(Xij)表示i處理j指標(biāo)的耐鋁隸屬函數(shù)值得，Xij表示i處理j指標(biāo)的測(cè)定值，Xjmax和Xjmin分別表示各處理中指標(biāo)的最大和最小的測(cè)定值，Xi為i處理的耐鋁隸屬函數(shù)值的平均值，n為指標(biāo)數(shù)。由于根系活力、POD、SOD與耐鋁性呈正相關(guān)，計(jì)算耐鋁性隸屬函數(shù)值時(shí)用A式；MDA含量與耐鋁性呈負(fù)相關(guān)，計(jì)算時(shí)用B式。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010和SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖，并進(jìn)行雙因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鋁脅迫對(duì)苜蓿株高的影響

表2所示，鋁脅迫會(huì)抑制苜蓿株高生長(zhǎng)，且供試材料的株高抑制率均隨著鋁脅迫濃度升高而增加，但不同材料在同一濃度下耐受性存在差異。各濃度鋁處理下，No.12的株高抑制率最低，均低于22%；在低濃度(<200 μmol·L-1)鋁處理時(shí)，株高抑制率最高的材料是No.5(>30%)；高濃度(≥200 μmol·L-1)鋁處理時(shí)，No.27的株高抑制率最高(>45%)。

表2 鋁脅迫下苜蓿株高抑制率的變化Table 2 The change of high inhibition rate of alfalfa plant under aluminum stress

注：同列不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

Note：Different lowercase letter in the same column indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

2.2 鋁脅迫對(duì)苜蓿根系伸長(zhǎng)的影響

由表3可知，濃度為50 μmol·L-1，No.5的根長(zhǎng)抑制率最高，為33.94%，No.18的根長(zhǎng)抑制率最低為13.24%；100 μmol·L-1鋁處理時(shí)，No.3的根長(zhǎng)抑制率最高(52.92%)，抑制率最低的是No.12(22.85%)；濃度為200 μmol·L-1，鋁脅迫對(duì)No.5的根長(zhǎng)抑制率最大，達(dá)到54.38%，No.21的抑制率最低(29.32%)；鋁處理濃度達(dá)到500 μmol·L-1時(shí)，根長(zhǎng)抑制率最高的是No.3(68.89%)，抑制率最低材料是No.12(37.47%)，各材料間差異顯著(P<0.05)。其中，No.27和No.21在低脅迫濃度(≤200 μmol·L-1)時(shí)，根長(zhǎng)抑制率變化平緩，高濃度(>200 μmol·L-1)鋁處理時(shí)根長(zhǎng)抑制率顯著升高(P<0.05)，No.22、No.18和No.5的根長(zhǎng)抑制率隨脅迫濃度增加而升高，在鋁脅迫為200～500 μmol·L-1濃度時(shí)，上升趨勢(shì)趨于平緩。比較4個(gè)鋁處理濃度下8份材料的根系相對(duì)伸長(zhǎng)率，耐鋁性表現(xiàn)最好的為No.12，最差的為No.3、No.5。

表3 鋁脅迫對(duì)苜蓿相對(duì)根長(zhǎng)抑制率的影響Table 3 The influence of aluminum stress on the relative root length inhibition rate of alfalfa

2.3 鋁脅迫對(duì)苜蓿根系活力變化的影響

如圖1所示，鋁處理會(huì)抑制苜蓿根系活力，8份苜蓿的根系活力均隨著鋁濃度升高而降低，但不同苜蓿材料在同一脅迫濃度下根系活力存在差異(P<0.05)。No.11、No.18、No.21和No.22根系活力變化趨勢(shì)較大，與對(duì)照組相比差異性最為顯著(P<0.05)；而No.3、No.5和No.27隨鋁脅迫濃度增加根系活力下降趨勢(shì)較為平緩。各材料的根系活力在500 μmol·L-1鋁處理時(shí)降至最低。

圖1 鋁對(duì)苜蓿根系活力的影響Fig.1 Changes of root vigor of alfalfa under aluminum stress注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05),下同Note：Values followed by a different small letter are significant (P<0.05),The same as below

2.4 鋁脅迫對(duì)苜蓿根尖丙二醛含量的影響

MDA是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生能加劇膜的損傷。由圖2可知，鋁脅迫下8份苜蓿材料根尖MDA含量有所增加，但同一材料在不同濃度下或不同材料在同一濃度下呈現(xiàn)不同變化趨勢(shì)。No.3根尖MDA含量隨著鋁脅迫濃度的增加顯著升高(P<0.05)；No.5、No.11和No.12根尖MDA含量呈先升高(50 μmol·L-1)后降低(100 μmol·L-1)再升高(200 μmol·L-1)后下降(500 μmol·L-1)；隨鋁處理濃度增加，No.18、No.21和No.22根尖丙二醛含量呈先升高后下降再升高趨勢(shì)，并在處理濃度增至500 μmol·L-1時(shí)達(dá)到最高；No.27的根尖丙二醛含量隨處理濃度升高至200 μmol·L-1達(dá)到最高后下降。

圖2 鋁對(duì)苜蓿根尖丙二醛含量的影響Fig.2 The effects of aluminum on MDA content of alfalfa root

2.5 鋁脅迫對(duì)紫花苜蓿根尖POD和SOD活性的影響

如圖3所示，鋁脅迫會(huì)降低苜蓿根尖POD活性，但不同材料對(duì)不同濃度脅迫下反應(yīng)敏感程度不同。8份苜蓿材料的根尖POD活性都是隨著鋁脅迫濃度升高而顯著降低(P<0.05)。低濃度(<200 μmol·L-1)鋁處理，No.11的根尖POD活性最高，No.5最低；隨處理濃度(≥200 μmol·L-1)升高，No.18根尖POD活性最高，No.5最低；No.11、No.22和No.18，在處理濃度為50～100 μmol·L-1下根尖的POD活性變化不明顯，受200～500 μmol·L-1濃度處理后呈顯著下降趨勢(shì)(P<0.05)，說(shuō)明No.12、No.11、No.22和No.18在高濃度脅迫下耐受性較低。

圖3 鋁對(duì)苜蓿根尖POD活性的影響Fig.3 Effects of aluminum on POD activity of alfalfa root tips

由圖4可見(jiàn)，隨著鋁脅迫濃度的增加供試苜蓿材料根尖SOD活性都呈下降趨勢(shì)，濃度為500 μmol·L-1時(shí)最低。各濃度鋁處理下，No.12的根尖SOD活性最高，No.3最低。其中，No.27、No.3和No.5材料較敏感，根尖SOD活性隨脅迫濃度升高顯著下降(P<0.05)；No.21、No.11和No.18在處理濃度為50～100 μmol·L-1時(shí)，SOD活性下降趨勢(shì)變化均不顯著(P>0.05)，而處理濃度升高至200～500 μmol·L-1時(shí)，這3份材料根尖SOD活性顯著降低，說(shuō)明低濃度鋁脅迫對(duì)其根尖的SOD活性影響不大，且隨著處理濃度升高，這三份材料耐受性變差。

圖4 鋁對(duì)苜蓿根尖SOD活性的影響Fig.4 Effects of aluminum on SOD activity of alfalfa root tips

2.6 綜合評(píng)價(jià)

8份苜蓿材料的耐鋁性評(píng)判結(jié)果如表4-表7所示。綜合供試苜蓿材料在各處理濃度下的指標(biāo)分析，No.12 和No.22材料均表現(xiàn)較好，其次為No.18，No.11，No.27，No.21，表現(xiàn)較差的材料為No.3，No.5。

表4 50 μmol·L-1處理下苜蓿耐鋁毒性綜合評(píng)判Table 4 Comprehensive evaluation of alfalfa resistance to 50 μmol·L-1 aluminium stress treatment

表5 100 μmol·L-1處理下苜蓿耐鋁毒性綜合評(píng)判Table 5 Comprehensive evaluation of alfalfa resistance to 100 μmol·L-1aluminium stress treatment

表6 200 μmol·L-1處理下苜蓿耐鋁毒性綜合評(píng)判Table 6 Comprehensive evaluation of alfalfa resistance to 200 μmol·L-1aluminium stress treatment

表7 500 μmol·L-1處理下苜蓿耐鋁毒性綜合評(píng)判Table 7 Comprehensive evaluation of alfalfa resistance to 500 μmol·L-1aluminium stress treatment

3 討論

本試驗(yàn)研究了不同濃度鋁脅迫下，8份云南苜蓿材料幼苗的生長(zhǎng)狀況及根尖生理生化指標(biāo)變化。其中株高和根長(zhǎng)是植物外在的形態(tài)指標(biāo)，也是耐受性強(qiáng)弱最直觀的反映。本研究中，8份材料的株高及根長(zhǎng)抑制率均隨處理濃度的升高呈上升趨勢(shì)，這與任曉燕等[22]對(duì)煙草植株高度受鋁脅迫影響顯著下降的研究及楊野等[23]和陳陽(yáng)等[24]對(duì)鋁脅迫下植物根伸長(zhǎng)的研究結(jié)果一致。且在本研究中，No.5、No.21和No.27的株高及根長(zhǎng)抑制率呈顯著升高后變化趨于平緩。有研究[25]表明，植物在低濃度處理下其株高和根伸長(zhǎng)受影響較大，隨著濃度的提高其變化量趨于平緩，主要原因是苜蓿材料的耐鋁性有一個(gè)閾值，在閾值范圍內(nèi)苜蓿能進(jìn)行自我調(diào)控和修復(fù)，超過(guò)閾值可能會(huì)使植物自我調(diào)節(jié)系統(tǒng)崩潰，影響植物的代謝水平，使植物生長(zhǎng)發(fā)育變緩慢，進(jìn)而影響植株及根系生長(zhǎng)。同時(shí)可以看出，當(dāng)植物面臨鋁脅迫時(shí)，能夠通過(guò)生理機(jī)能調(diào)節(jié)來(lái)減輕所受鋁脅迫的傷害。

根系活力的高低反映了植物根尖對(duì)養(yǎng)分的吸收和植物體內(nèi)的代謝作用、營(yíng)養(yǎng)狀況和產(chǎn)量水平，根系的生長(zhǎng)發(fā)育狀況和根系的活力強(qiáng)弱將直接影響植物個(gè)體的生命活動(dòng)。本研究中，8份苜蓿幼苗的根系活力隨著鋁處理濃度的增加而顯著降低，且不同材料在不同濃度下反應(yīng)敏感程度不同(圖1)，這與李德華等[26]對(duì)鋁脅迫下蕎麥根系活力研究及劉鵬等[27]對(duì)大豆幼苗根系活力對(duì)鋁脅迫響應(yīng)的研究結(jié)果一致。說(shuō)明鋁對(duì)8份苜蓿幼苗的根尖有毒害作用，作用效果隨處理濃度的增加而升高。此外，李德華的研究還證明了根系活力(TTC)相對(duì)還原強(qiáng)度與植物的耐受鋁脅迫性質(zhì)具有很強(qiáng)的一致性。植物細(xì)胞內(nèi)的活性氧化物質(zhì)累積會(huì)導(dǎo)致膜脂的過(guò)氧化并使得質(zhì)膜透性的增高。丙二醛的大量積累，破壞膜脂的結(jié)構(gòu)與功能，從而對(duì)植物造成傷害或死亡[28]。因此，可通過(guò)MDA含量了解膜脂過(guò)氧化的程度，以間接測(cè)定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。楊野[23]等研究發(fā)現(xiàn)鋁處理可以顯著提高小麥根的MDA含量，與本試驗(yàn)中苜蓿材料根尖的MDA含量變化一致，說(shuō)明鋁脅迫造成了苜蓿根尖細(xì)胞膜脂的過(guò)氧化，并造成了根尖細(xì)胞膜和質(zhì)膜的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)在使用鋁毒脅迫后，特別是在鋁處理濃度為200 μmol·L-1時(shí)能使苜蓿根系中的MDA含量顯著升高(圖2)。部分苜蓿材料(No.5、No.11、No.12、No.18)根尖MDA含量先降低而后升高，羅亮等[29]的研究也表明：低濃度鋁處理時(shí)，茶葉的中的MDA含量較對(duì)照低，隨著鋁的升高，MDA含量上升，這說(shuō)明適當(dāng)濃度的鋁有利于細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。

SOD和POD作為防止植物細(xì)胞中活性氧簇產(chǎn)生的重要抗氧化酶[30]，二者活性的提高與維持是植物耐鋁脅迫的重要生理基礎(chǔ)[6,31]，POD可把SOD等產(chǎn)生的H2O2變成H2O,使活性氧維持在一個(gè)較低的水平上[7]。SOD在保護(hù)酶中起著尤為重要的作用，植物的衰老與SOD活性的下降呈正相關(guān)[32]。本實(shí)驗(yàn)中受鋁毒脅迫處理的8份苜蓿材料根尖的兩種酶活性都隨脅迫強(qiáng)度的增大而呈下降趨勢(shì)，這與李智燕[33]等對(duì)鋁和酸脅迫下苜蓿根瘤菌的抗氧化酶系的研究和楊丹娜[1]等對(duì)苜蓿幼苗生長(zhǎng)受酸鋁脅迫的影響研究結(jié)果一致,表明了其耐受的協(xié)同性,并共同組成了防御過(guò)氧化系統(tǒng),抵抗環(huán)境不良條件對(duì)機(jī)體的破壞[6]。高濃度鋁(500 μmol·L-1)處理時(shí)，供試苜蓿幼苗根尖氧化酶活性下降至最低并造成苜蓿抗氧化酶系統(tǒng)破壞，這與在蕎麥[31]和蓼科植物[34]酸鋁脅迫研究中取得的結(jié)果一致。其中，No.21和No.5與對(duì)照組相比差異最顯著，變化趨勢(shì)最明顯，說(shuō)明鋁脅迫對(duì)其根尖酶活性影響較大，而No.12根尖兩種酶活性下降趨勢(shì)較平緩，表明該材料耐受性較其他苜蓿材料好(圖3，圖4)。

4 結(jié)論

低濃度(0～100 μmol·L-1)鋁處理對(duì)云南野生和逸生苜蓿的形態(tài)指標(biāo)的抑制作用較小，但苜蓿的根尖生理指標(biāo)受脅迫影響變化顯著；隨鋁脅迫濃度增加(≥200 μmol·L-1)，苜蓿地上、地下部分生長(zhǎng)明顯受到抑制，而生理指標(biāo)變化趨于平緩；隨著鋁處理濃度的增加，苜蓿根尖受脅迫影響隨之增大，氧化酶活性呈逐級(jí)遞減的趨勢(shì)(P<0.05)。

根據(jù)隸屬函數(shù)評(píng)價(jià)結(jié)果，可將8份苜蓿材料分為耐鋁型(No.12，No.22)、中等耐鋁型(No.11，No.18，No.21，No.27)和(No.3，No.5)敏感型三種。No.12在不同濃度鋁脅迫處理下耐鋁性表現(xiàn)均較好，可結(jié)合后期的品比試驗(yàn)表現(xiàn)，在南方酸性富鋁化土壤中推廣應(yīng)用。