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    NF-κB通路在自身免疫性甲狀腺炎發(fā)病過程中的作用

    2018-11-07 11:45:00祁崗朱艷媚李焱李玉娟羅世文李曼
    實用醫(yī)學(xué)雜志 2018年20期
    關(guān)鍵詞:甲狀腺炎免疫性造模

    祁崗 朱艷媚 李焱 李玉娟 羅世文 李曼

    1青海省人民醫(yī)院(西寧810007);2青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院(西寧810016)

    自身免疫性甲狀腺疾?。╝utoimmune thyroid disease,AITD)是病變部位主要發(fā)生在甲狀腺的器官特異性自身免疫性疾?。?],主要包括Graves?。℅D)和橋本甲狀腺炎(Hashimotos thyroiditis,HT)。AITD的發(fā)病機制尚未完全清楚,而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺細(xì)胞炎癥相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常、炎癥反應(yīng)失衡與自身免疫性甲狀腺疾病有很大的關(guān)系[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)在AI組織中,TNF-α、IL-1β、IFN-γ等炎癥因子高表達[4],其中 TNF-α 是NF-κB 通路的激活因子和效應(yīng)子,其表達變化即受到NF-κB信號通路的調(diào)控,同時反過來又去調(diào)控NF-κB通路,二者相互調(diào)控形成正反饋環(huán),加重炎癥[5]。作為重要的炎癥信號通路,NF-κB通路在多種炎癥疾病中異常激活,與炎癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6-7],已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在甲狀腺癌組織及其細(xì)胞中NF-κB通路異常激活,促進甲狀腺癌的發(fā)展[8-9],但是其在AITD發(fā)病過程中的作用并未被闡明。為此本研究將以NF-κB通路作為基礎(chǔ),研究自身免疫性甲狀腺炎發(fā)病的分子機制,為臨床治療AITD提供一定的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料昆明小鼠,清潔級,雌性,6~8周,體質(zhì)量18~22 g,購買自蘭州大學(xué)動物實驗中心,許可證號:SYXK(甘)2015-0005。CBA/j小鼠,清潔級,雌性,5~6周,體質(zhì)量16~20 g,購買自北京華阜康生物科技股份有限公司,許可證號:SCXK(京)2014-0004。

    上述小鼠均在在相對恒定溫度和相對濕度(25~27℃、40%~50%)條件下,12 h自然采光,按照清潔級標(biāo)準(zhǔn)采用標(biāo)準(zhǔn)飼料進行飼養(yǎng)。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,觀察無異常表現(xiàn)者即可入組進行實驗研究。該飼養(yǎng)條件貫穿整個實驗過程。標(biāo)準(zhǔn)飼料購買自北京科澳協(xié)力飼料有限公司,Sephadex G-200凝膠購買自索萊寶生物科技有限公司,完全弗氏佐劑(complete Freund′s adjuvant,CFA)和弗氏不完全佐劑(Freund incomplete adjuvant,F(xiàn)IA)購買自北京索萊寶生物科技公司,TNF-α ELISA試劑盒購買自上海酶聯(lián)生物科技有限公司,SP9001免疫組化試劑盒、RIPA裂解液、超敏型ECL檢測試劑、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、SDSPAGE蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE電泳液以及蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)膜液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;NF-κB、IKK抗體均屬于兔單克隆抗體,皆購自Abcam公司;HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購買自CST公司,Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒購買自Takara,引物有Takara公司。引物信息:TNF-α:上游5′-CCTCTAGCCCACGTCGTAGC-3′,下游5′-AGCAATGACTCCAAAGTAGACC-3′;Bcl-2:上游5′-TGACCCGCAGCAAGAAAGTG-3′,下游 5′-ATCTGTGGAGAAGACAGCTA-3′;ICAM-1:上游 5′-GACCACGGAGCCAATTTCTCA-3′,下游5′-TCCAGTTCCCCAAGCAGTCC-3′;β-actin:上游5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′,下游 5′-TAAAACGCA GCTCAGTAACAGTCCCG-3′。

    1.2 方法

    1.2.1 mTg蛋白純化將昆明小鼠的甲狀腺置于4℃預(yù)冷的0.01 mmol/L的PBS中,研磨成勻漿液后,4℃3 000 r/min,離心30 min,取上清再經(jīng)4℃10 000 g,離心1 h后,經(jīng)飽和度為42%、37%和42%硫酸銨3次沉淀,PBS重懸,4℃充分透析48 h,換液6次,去除硫酸銨,透析后凍干,進行Sephadex G-200凝膠層析純化,將純化后的收集物用蒸餾水透析,聚乙二醇20000反透濃縮,冷凍干燥,將上述方法再次進行凝膠層析。最后將mTg冷凍干燥,保存于-70℃冰箱。

    1.2.2 mTg蛋白鑒定將純化的蛋白加入4×上樣緩沖液,煮沸變性后,加到4%濃縮膠濃縮,10%分離膠分離,然后用考馬斯亮藍(lán)R250染色,根據(jù)條帶的分子量鑒定是否為甲狀腺球蛋白。

    1.2.3 動物飼養(yǎng)及造模參照文獻[10]進行造模:于8周齡時,將CBA/j小鼠隨機分為兩組,每組10只,其中對照組(control組)給予水+CFA,模型組(mTg組)給予100 μg/鼠的mTg+CFA皮下注射初次免疫,10周齡時模型組再給予相同mTg+FIA重復(fù)免疫1次,14周齡時處死小鼠,取血清及甲狀腺組織進行檢測,并參照HE染色結(jié)果對模型進行評價。

    1.2.4 HE染色摘取甲狀腺組織,PBS洗滌后,4%多聚甲醛固定1周后,經(jīng)脫水后,石蠟包埋,切成4 μm切片,進行HE染色。光鏡下觀察甲狀腺組織的炎癥細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞)浸潤程度,EAT炎癥分級標(biāo)準(zhǔn):<1級為正常,≥ 1、< 2級為輕度,≥ 2、< 3級為中度,3~4級為重度。

    1.2.5 ELISA實驗眼球取血后,將血液于室溫放置30 min,待其凝固后,3 000 r/min離心10 min,取血清,按照說明書進行ELISA實驗,450 nm波長測量各孔OD值。

    1.2.6 qPCR實驗用Trizol法提取甲狀腺組織總mRNA,然后按照Takara反應(yīng)試劑盒依次經(jīng)過去除基因組DNA反應(yīng)、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和qPCR進行擴增,擴增程序為:預(yù)變性:95℃、10 min、1循環(huán)數(shù);擴增:95 ℃、15 s,60 ℃、15 s,72 ℃、30 s、40循環(huán)數(shù)。

    1.2.7 Western bloting實驗甲狀腺組織中加入RIPA裂解液,置于冰上研碎至勻漿后,4℃放置30 min,13 000 r/min離心10 min,取一部分上清,BCA試劑盒檢測蛋白濃度,另一部分上清加入4×上樣緩沖液,煮沸變性后,進行SDS-PAGE凝膠電泳,經(jīng)4℃孵育一抗、室溫孵育二抗、ECL發(fā)光液顯色、X醫(yī)用膠片顯影、定影等步驟,最后進行拍照分析。

    1.2.8 免疫組化實驗按照SP免疫組化試劑盒說明書進行實驗。甲狀腺組織切片經(jīng)過抗原熱修復(fù)、封閉、依次孵育一抗、生物素標(biāo)記的二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素后,DAB顯色液顯色,至顯色程度適宜,終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染2 min,用自來水沖洗切片,鹽酸酒精分色,洗滌后,將切片脫水、二甲苯透明,中性樹膠封片,晾干后拍照分析。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0軟件包,多組間比較用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,均以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 蛋白純化及鑒定由圖1可知,在純化mTg過程中,圖1A中第一個峰代表丙酮分子,單一平滑表明柱子安裝合格。第二個峰圖代表分離純化的甲狀腺球蛋白,文獻報道在甲狀腺中,甲狀腺球蛋白分子量是最大的,因此第二個峰推測即為甲狀腺球蛋白,進行收集。為驗證是否為甲狀腺球蛋白,進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,圖1B中三條帶為稀釋不同濃度的收集的純化蛋白,根據(jù)分子量顯示分析為甲狀腺球蛋白且蛋白純度較高,達到實驗動物造模的要求。

    圖1 甲狀腺球蛋白的純化與鑒定Fig.1 Purification and identification of thyroglobulin

    2.2 病理變化與Control組相比,mTg組甲狀腺組織可見甲狀腺濾泡體積變小,數(shù)量明顯增多,形狀不規(guī)則,濾泡間壁膜增厚,細(xì)胞增多,可見大量炎癥細(xì)胞浸潤。評分后,mTg組甲狀腺組織炎癥嚴(yán)重程度均達到3級以上,可見10%~40%的甲狀腺組織被炎癥細(xì)胞取代;或超過40%的甲狀腺組織被炎癥細(xì)胞取代。見圖2。

    圖2 甲狀腺組織病理變化Fig.2 Pathological changes in thyroid tissue

    2.3 血清中TNF-α含量變化與對照組相比,mTg組血清中TNF-α含量顯著上升,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1、圖3。

    2.4 甲狀腺組織中TNF-α、Bcl-2、ICAM-1 mRNA變化與對照組相比,mTg組甲狀腺組織中TNF-α mRNA、Bcl-2 mRNA、ICAM-1 mRNA表達明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2、圖4。

    表1 小鼠血清中TNF-α濃度變化Tab.1 Changes of TNF-α levels in mice serum ±s,ng/L

    表1 小鼠血清中TNF-α濃度變化Tab.1 Changes of TNF-α levels in mice serum ±s,ng/L

    注:與Control組比較,**P <0.01

    分組Control組mTg組TNF-α 83.37±11.39 185.42±13.36**

    圖3 小鼠血清中TNF-α濃度變化Fig.3 Changes of TNF-α levels in mice serum

    表2 各組小鼠甲狀腺組織中TNF-α、Bcl-2、ICAM-1 mRNA變化Tab.2 Changes of TNF-α,Bcl-2 and ICAM-1 mRNA level in thyroid tissue ±s

    表2 各組小鼠甲狀腺組織中TNF-α、Bcl-2、ICAM-1 mRNA變化Tab.2 Changes of TNF-α,Bcl-2 and ICAM-1 mRNA level in thyroid tissue ±s

    注:與Control組相比,**P<0.01

    分組Control組mTg組TNF-α 1.00±0.00 2.38±0.13**Bcl-2 1.00±0.00 2.11±0.12**ICAM-1 1.00±0.00 2.24±0.13**

    2.5 甲狀腺組織中NF-κB蛋白變化與對照組相比,mTg組甲狀腺組織中NF-κB蛋白表達明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3、圖5。

    表3 各組小鼠甲狀腺組織中NF-κB蛋白表達變化Tab.3 Changes of NF-κB protein in thyroid tissue ±s

    表3 各組小鼠甲狀腺組織中NF-κB蛋白表達變化Tab.3 Changes of NF-κB protein in thyroid tissue ±s

    注:與Control組相比,**P<0.01

    分組Control組mTg組NF-κB 0.52±0.07 0.93±0.11**

    2.6 甲狀腺組織中IKK蛋白變化與對照組相比,mTg組甲狀腺組織中IKK蛋白表達明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

    3 討論

    圖4 甲狀腺組織中TNF-α、Bcl-2、ICAM-1 mRNA變化Fig.4 Changes of TNF-α,Bcl-2 and ICAM-1 mRNA level in thyroid tissue

    圖5 甲狀腺組織中NF-κB蛋白變化Fig.5 Changes of NF-κB protein in thyroid tissue

    圖6 甲狀腺組織中IKK蛋白變化Fig.6 Changes of IKK protein in thyroid tissue

    為了給臨床治療提供一定的理論依據(jù),本研究通過建造自身免疫性甲狀腺炎模型探索其發(fā)病機制,在造模過程中用CBA/j小鼠,采用多次注射mTg進行免疫的造模方法,建造自身免疫性甲狀腺炎模型。HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠在造模完成后,甲狀腺組織中大量炎癥細(xì)胞浸潤,導(dǎo)致濾泡明顯增多,體積減小,泡間壁厚度增厚,濾泡呈明顯不規(guī)則樣,可見明顯的發(fā)炎癥狀,提示造模成功。

    AITD作為免疫性疾病,其發(fā)病多與免疫細(xì)胞、免疫因子及其免疫相關(guān)信號通路相關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn),在甲狀腺血管中TGF-β、TNF-α、IL-1α、IL-8等炎癥因子的高表達,促進了甲狀腺的炎癥介質(zhì)、黏附分子、趨化因子和一些相關(guān)酶類的過度或持續(xù)表達[11-12],與本研究結(jié)果一致,在自身免疫性甲狀腺疾病模型鼠血清中TNF-α含量明顯增加。TNF-α作為最重要的炎癥介質(zhì)之一,其高表達不僅導(dǎo)致炎癥部位細(xì)胞釋放大量炎癥介質(zhì)和趨化因子,同時激活體內(nèi)的炎癥細(xì)胞,加重炎癥[13]。TNF-α可激活體內(nèi)多條炎癥相關(guān)信號通路[13],包括NF-κB信號通路,同時TNF-α基因含有NF-κB的特異性結(jié)合位點,即TNF-α的表達可受NF-κB的調(diào)控,因此TNF-α與NF-κB信號通路可形成正反饋環(huán)[15],相互促進,使炎癥進一步加重。這種正反饋環(huán)在很多疾病中被發(fā)現(xiàn),參與疾病的炎癥反應(yīng)。在本研究中發(fā)現(xiàn)NF-κB在模型組小鼠甲狀腺組織中表達顯著升高,同時作為NF-κB的激活因子IKK的表達在模型組甲狀腺組織中同樣顯著升高,以上提示NF-κB信號通路在自身免疫性甲狀腺模型組織中被激活。其可能與TNF-α形成正反饋環(huán),促進AITD的發(fā)生發(fā)展,但具體機制還需進一步實驗證實。激活的NF-κB不僅調(diào)控TNF-α的表達,同時可啟動下游與凋亡、存活、增殖、遷移等相關(guān)蛋白的表達,廣泛參與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等多種生理、病理過程的基因調(diào)控[16],其中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2以及黏附遷移相關(guān)蛋白ICAM-1基因的啟動子中皆含有NF-κB轉(zhuǎn)錄因子識別結(jié)合序列,二者受NF-κB的激活調(diào)控[17-18]。已有研究表明在炎癥組織中Bcl-2高表達抑制炎癥細(xì)胞凋亡,促進細(xì)胞增殖,加重炎癥[19],而ICAM-1在炎癥組織中高表達可促進炎癥細(xì)胞的浸潤[20],研究發(fā)現(xiàn)在炎癥過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞表達的ICAM-1不僅介導(dǎo)淋巴細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附,促使淋巴細(xì)胞向炎癥部位浸潤并釋放多種炎性因子,而且炎癥組織中炎性因子又可刺激誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達ICAM-1,從而促使更多的細(xì)胞向炎癥部位遷移[21]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠甲狀腺組織中Bcl-2 mRNA、ICAM-1 mRNA高表達,提示其可促進AITD炎癥的發(fā)生、發(fā)展,并且其高表達可能是由NF-κB的異常表達造成的。

    綜上可知在自身免疫性甲狀腺炎發(fā)病過程中,NF-κB通路異常激活,并與TNF-α形成正反饋環(huán)導(dǎo)致NF-κB通路持續(xù)激活,啟動Bcl-2和ICAM-1基因表達,促使炎癥細(xì)胞增殖、浸潤至甲狀腺組織,促進AITD的發(fā)生發(fā)展。

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