銀杏葉提取物的免疫調(diào)節(jié)作用研究

溫 銳，王 儉

0 引言

銀杏葉性甘、味苦、澀、平，歸心、肺經(jīng)，有斂肺、平喘、活血化瘀、止痛等功效。研究表明，銀杏葉所含的藥用活性成分較多，包括萜烯酯和黃酮苷等，對多種疾病具有良好的預(yù)防和治療作用[1-3]。近年來，因?yàn)榄h(huán)境污染、工作壓力激增等因素，臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，機(jī)體免疫異常的患者數(shù)量有逐年增加的趨勢。人體免疫功能低下會(huì)誘發(fā)很多疾病。因此，亟待尋找合適、可有效調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的藥物。目前，銀杏葉提取物對免疫功能影響的相關(guān)報(bào)道很少。 本研究擬通過觀察銀杏葉提取物對免疫功能低下小鼠免疫功能的影響，為臨床實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品、試劑及儀器 藥品：銀杏葉提取物片(商品名：金納多片，40 mg/片，德國威瑪舒培博士大藥廠，批號：H20090365)；環(huán)磷酰胺(200 mg/支，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：H32020857)。試劑：綿羊紅細(xì)胞(SRBC)，沈陽市大東區(qū)前進(jìn)生物制劑廠；2,4-二硝基氯苯(DNCB)，南開大學(xué)精細(xì)化工實(shí)驗(yàn)廠，批號：921020；都氏試劑：碳酸氫鈉1.0 g，氰化鉀0.5 g，高鐵氰化鉀0.2 g，加純化水溶解至1 L，混勻。儀器：CL-770全自動(dòng)生化分析儀，日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，18～22 g，雌雄各半(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號：SCXK[遼]2003-0013)。

2 方法

2.1 免疫功能低下小鼠碳粒廓清模型 按文獻(xiàn)方法[4]，選取昆明種實(shí)驗(yàn)小鼠50只，雌雄各半，分為空白對照組、模型對照組和實(shí)驗(yàn)組(銀杏葉提取物高、中、低劑量組)，每組10只。實(shí)驗(yàn)組小鼠分別口服灌胃給予銀杏葉提取物40、20、10 mg，空白對照組和模型對照組口服灌胃給予0.5%CMC-Na 20 ml/kg。除空白對照組之外，其余四組均于給藥的第3～5天，腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg，每日1次；末次給藥后1 h，小鼠尾靜脈處注射墨汁10 μl/g。注射墨汁2 min(t1)、12 min(t2)后，分別從小鼠眼眶靜脈叢處取血25 μl，溶于3 ml的0.1% Na2CO3溶液中混合均勻。取0.1% Na2CO3溶液作為空白對照，與波長680 nm比色測OD值。最后，將小鼠處死，立即取肝臟和脾臟，去除血污后進(jìn)行稱重，并按如下公式計(jì)算樣品的廓清指數(shù)(κ值)及吞噬指數(shù)(α值)。

2.2 免疫功能低下小鼠溶血素抗體生成模型 昆明種小鼠，雌雄各半，分組及給藥方法同“2.1”。各組小鼠均于給藥第3天，腹腔注射0.2 ml綿陽紅細(xì)胞(SRBC，含量20%)。除空白對照組之外，其他四組均在致敏當(dāng)日腹腔注射給予環(huán)磷酰胺20 mg/kg，連續(xù)腹腔注射3 d。末次給藥1 h后，于小鼠眼眶靜脈叢處取血并分離血清。每2 μl血清加1 ml生理鹽水(稀釋倍數(shù)500)，再加入0.5 ml 5% SRBC，1 ml的10%豚鼠血清補(bǔ)體。將所得溶液樣本，放于37 ℃恒溫水浴中保溫30 min，最后移至冰浴中使反應(yīng)終止。以1 500 r/min速度離心5 min，取上清液1 ml并加都氏試劑3 ml，搖勻之后靜置10 min，使用540 nm波長熒光進(jìn)行比色并讀取吸光度。SRBC半數(shù)溶血數(shù)值的測試方法為：在0.25 ml 5% SRBC中加都氏試劑至總體積4 ml，測定吸光度值，并計(jì)算HC50數(shù)值[5]

2.3 免疫功能低下小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型 昆明種小鼠，雌雄各半，分組方法及給藥方法同“2.1”。按照文獻(xiàn)建議方法[6]，各組小鼠背部均皮下注射0.35 mol/L的DNCB丙酮液30 μl致敏；致敏后從第4天開始，各組小鼠連續(xù)給藥7 d。除空白對照組外，其余四組均于給藥后第3天、第5天，腹腔注射50 mg/kg的環(huán)磷酰胺。末次給藥1 h后，在小鼠右耳廓前后涂抹0.35 mol/L的DNCB丙酮液25 μl激發(fā)，16 h后處死，用9 mm打孔器于小鼠兩耳相同部位打下耳片并稱重，用下列公式計(jì)算腫脹度。

腫脹度(mg)=右耳片質(zhì)量(mg)-左耳片質(zhì)量(mg)

3 結(jié)果

3.1 銀杏葉提取物對免疫低下小鼠碳粒廓清的影響 由表1結(jié)果可見，免疫功能低下小鼠口服灌胃給予不同劑量銀杏葉提取物后，小鼠κ值和α值均呈改善趨勢。與模型對照組相比，銀杏葉提取物40、20 mg/kg劑量組κ值、α值升高(P<0.01或P<0.05)。

表1 銀杏葉提取物對免疫功能低下小鼠碳粒廓清的影響(n=10)

注：與模型對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

3.2 銀杏葉提取物對免疫低下小鼠溶血素抗體生成的影響 免疫功能低下小鼠口服灌胃給予不同劑量銀杏葉提取物后，HC50均呈升高趨勢。與模型對照組比較，銀杏葉提取物40、20 mg/kg劑量組對免疫功能低下小鼠的免疫功能改善差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；銀杏葉提取物10 mg/kg 劑量組HC50有升高的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠HC50、耳腫脹度比較

注：與模型對照比較，*P<0.05,**P<0.01

3.3 銀杏葉提取物對免疫低下小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響 免疫功能低下小鼠，分別給予不同劑量銀杏葉提取物后，耳腫脹程度呈加重趨勢，加重耳腫脹程度與劑量呈相關(guān)趨勢。與模型對照組比較，銀杏葉提取物40、20 mg/kg劑量組均顯著加重由DNCB誘發(fā)的耳腫脹(P<0.01或P<0.05)。見表2。

4 討論

自20世紀(jì)60年代起，國內(nèi)外許多學(xué)者對銀杏及其提取物的藥理作用進(jìn)行了大量的研究。研究結(jié)果表明，銀杏葉提取物具有擴(kuò)張腦血管、增加腦血管流量、降低毛細(xì)血管通透性、清除自由基等作用，能夠有效治療心腦血管類疾病[7-11]。此外，研究顯示，銀杏葉提取物還具有降低血脂的作用，并可通過改善糖耐量等方式，顯著降低老年患者的血糖代謝及高胰島素血癥[12-13]。近年來，有報(bào)道，銀杏葉提取物對于腫瘤細(xì)胞也具有一定的抑制作用[14]。

銀杏葉提取物除了具有拮抗血小板活化因子、清除氧自由基和降血脂等作用外，近年來，隨著免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病發(fā)病率逐年升高，其對免疫系統(tǒng)功能的作用也引起了越來越多學(xué)者的重視[15]。本研究采用環(huán)磷酰胺制作小鼠免疫功能低下模型，從非特異性免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫三方面，觀察銀杏葉提取物對免疫功能低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，與模型對照組相比，銀杏葉提取物40、20 mg/kg劑量對免疫功能低下小鼠具有顯著的改善，這種改善效果呈現(xiàn)劑量依賴性，尤以40 mg/kg組改善效果最為顯著。由本研究結(jié)果可見，給予免疫功能低下小鼠適當(dāng)劑量的銀杏葉提取物，可有效改善其特異性和非特異性免疫功能。

本研究中，我們通過建立不同的免疫功能低下小鼠模型，獲得了銀杏葉提取物可改善免疫功能的結(jié)果，為今后其他學(xué)者深入開展有關(guān)銀杏葉提取物的臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)和支持。由于實(shí)驗(yàn)條件等因素的限制，本研究結(jié)果只是從免疫功能低下小鼠模型中獲得，銀杏葉提取物調(diào)節(jié)免疫功能的具體機(jī)制，需要在今后深入研究。