腫瘤標志物、PTTG、VEGFR-3及血流參數(shù)在宮頸病變中的價值*

吉潔，申興斌，韓冰，張玉娟，馬志君

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1.南院區(qū)病案室，2.病理科，3.婦科，4.神經(jīng)外科，河北 承德 067000）

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于乳腺癌。其發(fā)病年齡趨向年輕化、病死率高，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，嚴重威脅女性生殖健康[1]。宮頸癌早期癥狀不典型，大部分就診時已進展至中晚期，錯失最佳治療時機。一般認為，宮頸癌的發(fā)生及進展為持續(xù)性病變的過程（包括不典型增生-原位癌-早期清潤癌-浸潤癌）。自宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（cervicalint raepithelialneoplasia, CIN）發(fā)展至宮頸癌浸潤癌時間約為6、7年[2]，早期檢出CIN為防治宮頸病變進展為宮頸癌的關(guān)鍵途徑。而腫瘤發(fā)病為多基因、多因素共同作用的過程（包括原癌基因激活、抑癌基因喪失活性及DNA修復(fù)基因缺陷等）。垂體瘤轉(zhuǎn)化基因（pituitary tumor-transforming gene, PTTG）系自大鼠GH4垂體細胞內(nèi)分離的原癌基因[3]，其在組織增殖、轉(zhuǎn)化及腫瘤發(fā)生等過程中均有重要作用。且在子宮內(nèi)膜、腎上腺及卵巢等腫瘤中均呈高表達狀態(tài)，而在胸腺、睪丸以外正常組織中表達水平極低[4]。血管內(nèi)皮生長因子受體3（vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3）則為最早發(fā)現(xiàn)淋巴管特異性調(diào)控受體，主要表達與淋巴結(jié)管內(nèi)皮及受損血管內(nèi)皮中，同時也表達于血管內(nèi)皮形成初期階段、新生血管內(nèi)皮及腫瘤細胞內(nèi)，參與血管內(nèi)皮生長因子C（vascular endothelial growth factor C, VEGF-C）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及淋巴管內(nèi)皮細胞增殖、分化等過程[5]。而微血管密度（microvascular density, MVD）及血流動力學(xué)指標則反映腫瘤新生血管生成及血流灌注的重要指標[6]，可作為評估宮頸病變進展的依據(jù)?；诖?，為探討腫瘤標志物、PTTG、VEGFR-3及血流動力學(xué)指標在宮頸良惡性病變中的表達及臨床意義，現(xiàn)對該院收治的98例宮頸病變患者的臨床資料進行回顧性分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性研究2012年3月-2016年2月該院收治且經(jīng)病理確診的97例宮頸病變患者的臨床資料。慢性宮頸炎患者20例。年齡23～54歲，平均（42.6±5.4）歲；均為患子宮脫垂、子宮腺肌瘤或子宮肌瘤在該院行子宮切除術(shù)者，無其他內(nèi)科合并癥，術(shù)后均經(jīng)病理確診為慢性宮頸炎。CIN 47例。年齡26～59歲，平均（44.3±6.2）歲，均為該院接受子宮切除術(shù)或?qū)m頸錐切術(shù)病例，無內(nèi)科合并癥，術(shù)后經(jīng)病理證實為CIN。其中CIN Ⅰ級20例，Ⅱ級13例，Ⅲ級14例。宮頸浸潤癌患者30例。年齡27～63歲，平均（47.6±7.1）歲，均行子宮癌根治術(shù)或全子宮切除術(shù)，術(shù)前均未進行放化療，術(shù)后經(jīng)病理確診，國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟宮頸癌分期（FIGO）Ⅰ期10例，Ⅱ期13例，Ⅲ期7例；分化程度：高中分化20例，低分化11例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例；所有病例均有石蠟標本及外周血標本存檔；入院后均完成超聲檢查，有明確血流動力學(xué)檢查資料；無其他部位原發(fā)惡性腫瘤；既往無宮頸手術(shù)史；且病例資料完整。

1.2 主要試劑及儀器

兔抗人PTTG多克隆抗體、兔抗人VEGFR-3多克隆抗體、鼠抗人D2-40單克隆抗體（購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），免疫組織化學(xué)Max Vision試劑盒、DAB顯色試劑盒（購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），西門子Compact-XP全自動電化學(xué)發(fā)光儀及配套試劑盒（購自德國西門子公司），立鶴電熱恒溫箱（山東濰坊醫(yī)療器械廠），低溫冰箱（青島海爾電器股份有限公司），BX40F4顯微鏡及照相系統(tǒng)（日本Olympus公司），自動脫水機、旋轉(zhuǎn)式切片機（英國Shandon Thrmo公司），彩色多普勒超聲診斷儀（美國GE公司）。

1.3 方法

①腫瘤標志物水平測定：取血液標本，離心后分離血清備用，采用全自動電化學(xué)發(fā)光及配套試劑盒、校準液及質(zhì)控品，應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光法測定所有患者血清血清鱗狀細胞癌抗原（squamous cell carcinoma, SCC）、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9, CA199）、糖類抗原125（carbohydrate antigen 125,CA125） 水 平。 ② PTTG、VEGFR-3、MVD測 定：采用免疫組織化學(xué)法，取病理蠟塊，常規(guī)切片，厚度5 μm，電熱恒溫箱高溫（80℃）烘烤50 min，常規(guī)脫蠟至水，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline,PBS）沖洗3次，每次5 min，滴入3%過氧化氫清除內(nèi)源性過氧化物酶活性，蒸餾水沖洗，PBS沖洗3次×5 min，加熱至沸騰，熱抗原修復(fù)，室溫冷卻，PBS沖洗3次，每次5 min，加正常山羊血清，37℃孵育0.5 h，滴加一抗（兔抗人PTTG多克隆抗體、兔抗人VEGFR-3多克隆抗、鼠抗人D2-40單克隆單體）50 μl于載玻片，4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3次，每次5 min，加入生物素標記二抗（酶標羊抗鼠/兔免疫球蛋白G復(fù)合物），室溫孵育0.5 h，PBS沖洗3次，每次5 min，DAB顯色5 min后終止，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，封片，鏡下觀察。③血流動力學(xué)測定：所有患者（非月經(jīng)期）術(shù)前1周均采用Logiq S6型彩色多普勒超聲診斷儀（美國GE公司）檢查血流動力學(xué)，常規(guī)探查腹部后取截石位，探頭套避孕套，涂耦合劑，緩慢置入陰道內(nèi)，觀察內(nèi)部血流狀況，連續(xù)監(jiān)測3個穩(wěn)定周期，記錄收縮期峰值血流速度（peak systolic velocity, PSV）、舒張末期血流速度（end diastolic velocity, EDV）及血管阻力指數(shù)（resitance index, RI）。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

PTTG、VEGFR陽性表達定位于細胞漿內(nèi)，呈棕黃色，選取5個高倍視野，觀察其陽性表達情況，以陽性細胞所占比例及染色強度進行評分。陽性細胞所占比例為1分：＜25%；2分：25%～50%；3分：＞50%。染色輕度：0分為不著色；1分：淺棕黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色。染色結(jié)果（陽性細胞所占比例評分×染色強度評分）：陰性（-）為0分；弱陽性（+）：1、2分；中度陽性（++）：3、4分；強陽性（+++）：＞4分。D2-40陽性表達定位于內(nèi)皮細胞膜及胞漿、參照Weidner標準[7]，選取腫瘤微血管數(shù)量豐富區(qū)域作為觀察區(qū)，重復(fù)選取5個視野，取均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，多組比較進行方差分析，組內(nèi)行LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同類型宮頸病變患者腫瘤標志物水平比較

慢性宮頸炎、CIN及宮頸浸潤癌患者SCC、CA199及CA125水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。慢性宮頸炎患者SCC、CA199及CA125水平均低于CIN與宮頸浸潤癌患者（P＜0.05）；CIN患者SCC、CA199及CA125水平低于宮頸浸潤癌患者（P＜0.05）。見表 1。

2.2 不同類型宮頸病變患者PTTG、VEGFR-3表達陽性情況比較

慢性宮頸炎、CIN及宮頸浸潤癌患者PTTG、VEGFR-3表達陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。CIN、宮頸浸潤癌患者PTTG、VEGFR-3表達陽性率高于慢性宮頸炎患者（P＜0.05）；宮頸浸潤癌患者PTTG、VEGFR-3表達陽性率高于CIN患者（P＜0.05）。見表2和圖1、2。

表1 不同類型宮頸病變患者腫瘤標志物水平比較（±s）

表1 不同類型宮頸病變患者腫瘤標志物水平比較（±s）

注：1）與慢性宮頸炎比較，P ＜0.05；2）與CIN比較，P ＜0.05

組別 SCC/（ng/ml） CA199/（u/ml） CA125/（u/ml）慢性宮頸炎組（n =20） 1.15±0.14 10.11±3.79 13.06±5.14 CIN組（n =47） 3.21±1.441） 15.22±5.261） 20.89±7.881）宮頸浸潤癌組（n =30） 11.08±3.171）2） 48.39±10.271）2） 46.51±11.021）2）F值 23.987 32.935 24.785 P值 0.000 0.000 0.000

表2 不同類型宮頸病變患者PTTG、VEGFR-3表達陽性情況比較

圖1 不同類型宮頸病變患者PTTG表達 （SP×200）

圖2 不同類型宮頸病變患者VEGFR-3表達 （SP×200）

2.3 不同類型宮頸病變患者MVD、PSV、EDV及RI指標比較

慢性宮頸炎、CIN及宮頸浸潤癌患者MVD、PSV、EDV及RI比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。慢性宮頸炎患者MVD低于CIN、宮頸浸潤癌患者（P＜0.05），CIN患者MVD低于宮頸浸潤癌患者（P＜0.05）。CIN、宮頸浸潤癌患者PSV、EDV均高于慢性宮頸炎患者（P＜0.05），而 RI低于慢性宮頸炎患者（P＜0.05）；宮頸浸潤癌患者PSV、EDV高于CIN患者，而RI低于CIN 患者（P＜0.05）。見表 3。

表3 不同類型宮頸病變患者MVD、血流動力學(xué)指標的比較 （±s）

表3 不同類型宮頸病變患者MVD、血流動力學(xué)指標的比較 （±s）

注：1）與慢性宮頸炎比較，P ＜0.05；2）與CIN比較，P ＜0.05

組別 MVD PSV/（cm/s） EDV/（cm/s） RI慢性宮頸炎組（n =20） 7.11±1.67 30.26±7.14 6.82±1.22 1.56±0.44 CIN組（n =47） 10.27±1.561） 38.71±7.691） 10.26±2.761） 1.15±0.121）宮頸浸潤癌組（n =30） 16.33±2.171）2） 52.64±10.261）2） 16.52±2.891）2） 0.67±0.361）2）F值 39.544 16.878 28.842 16.784 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

宮頸癌是女性常見生殖道惡性腫瘤，近年來發(fā)病趨向年輕化[8]。人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus, HPV）感染是引起宮頸癌發(fā)病的主要原因，此外性生活提前、不良性行為等均與宮頸癌發(fā)病有關(guān)[9]。隨分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，癌基因在宮頸癌發(fā)生及進展中的作用日益引起臨床研究者的關(guān)注[10]。PTTG系在大鼠垂體腫瘤中克隆出的新型促腫瘤生長及轉(zhuǎn)移原癌基因，定位于5號染色體長臂，與多類腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)[11]。PTTG基因包括5個外顯子與4個內(nèi)含子，編碼200余個氨基酸，其轉(zhuǎn)錄起點位于第一外顯子區(qū)，存在多個可與轉(zhuǎn)錄因子共同作用的核苷酸序列，包含不同反應(yīng)元件序列及結(jié)合位點，而轉(zhuǎn)錄因子則可與上述位點共同作用，調(diào)節(jié)PTTG在不同組織表達情況。研究發(fā)現(xiàn)，人體正常卵巢、肝臟、大腦及腎臟等組織，無PTTG表達或表達水平極低，而在胸腺、睪丸等組織則呈高表達[12]。DANG等[13]對子宮內(nèi)膜癌患者病理組織PTTG表達情況進行檢測發(fā)現(xiàn)，其表達水平高于增生子宮內(nèi)膜組織及正常子宮內(nèi)膜組織。張紅平等[14]對晚期卵巢癌患者進行癌基因篩查發(fā)現(xiàn)，卵巢癌PTTG呈高表達。但對宮頸病變患者PTTG表達情況尚少見報道。本研究選取慢性宮頸炎、CIN及宮頸浸潤癌患者分別檢測患者宮頸組織PTTG表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性宮頸炎患者未見PTTG陽性表達，而宮頸浸潤癌患者PTTG表達陽性率高于CIN，推測PTTG在宮頸癌發(fā)病早期即存在異常表達，在患者出現(xiàn)CIN時，PTTG表達增多，大量激活，過度表達促成宮頸癌發(fā)病。分析其機制則主要與PTTG可促進c-myc基因轉(zhuǎn)錄，影響染色體正常分離，導(dǎo)致異倍體產(chǎn)生，增加組織突變風(fēng)險，促進腫瘤表型轉(zhuǎn)化有關(guān)。其次，PTTG蛋白含堿性區(qū)與酸性區(qū)，其中酸性區(qū)可募集多個細胞內(nèi)信號分子，傳遞生長刺激信號至細胞核，激活多類腫瘤基因表達，促進細胞變性。

VEGFR-3則為VEGF-C同源受體，又稱作fms樣絡(luò)氨酸激酶4，多表達于正常組織、胚胎組織淋巴管內(nèi)皮細胞內(nèi)，系特異性淋巴管內(nèi)皮細胞標志物，在傳遞內(nèi)皮細胞有絲分裂信號中起關(guān)鍵作用[15]。陳曉露等[16]發(fā)現(xiàn)，VEFR-C與VEGFR-3 兩者結(jié)合可導(dǎo)致受體絡(luò)氨酸磷酸化，激活促分裂原活性蛋白激酶通路，引起淋巴管內(nèi)皮細胞增殖，促進淋巴管生成。有學(xué)者進行動物試驗發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)接種VEGF-C細胞株可促進腫瘤淋巴管生成[17]。李龍等[18]研究指出，胃癌、肺癌等易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的實體瘤患者VEGFR-3通常呈高表達，且表達水平與腫瘤浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后存在密切關(guān)聯(lián)。本研究對宮頸病變患者病變組織VEGFR-3表達情況進行檢測發(fā)現(xiàn)，宮頸浸潤癌患者VEGFR-3表達陽性率高于CIN及慢性宮頸炎患者，推測VEGFR-3表達上升，可能增加脈管通透性，促進內(nèi)皮細胞增殖、轉(zhuǎn)移，提升癌細胞對淋巴管的趨化作用，促進癌細胞播散，導(dǎo)致癌細胞轉(zhuǎn)移至淋巴管。宮頸浸潤癌患者MVD及腫瘤標志物水平SCC、CA199及CA125均高于CIN及慢性宮頸炎，且其血流動力學(xué)指標PSV、EDV均快于CIN、慢性宮頸炎，RI低于CIN、慢性宮頸炎，提示宮頸浸潤癌患者腫瘤標志物水平上調(diào)幅度高，MVD上升，新生血管生成增多，同時腫瘤組織血流速度加快，局部血流豐富，且腫瘤新生血管管壁薄，血管網(wǎng)紊亂，管腔不規(guī)則擴張，引起動靜脈瘺、血管湖形成，導(dǎo)致血流阻力降低。而慢性宮頸炎及CIN患者血管通透性低，血流阻力高，惡性程度低，提示腫瘤血管生成在宮頸組織癌變過程中有其重要作用。

綜上所述，宮頸浸潤癌患者癌組織PTTG、VEGFR-3陽性表達率高，且腫瘤標志物水平呈高表達，MVD上升、腫瘤新生血管生成多、血流速度快，與宮頸良性病變有差異。推測PTTG、VEGFR-3均可引起宮頸細胞表型改變，促進癌細胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及新生血管形成，在宮頸癌發(fā)病中有其重要的協(xié)同效應(yīng)。