超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿中鹽酸氨溴索及其制劑的生物等效性評價

賀美蓮， 郭常川， 冷佳薇， 張迅杰， 咸瑞卿，鞏麗萍， 石 峰， 姜 瑋

(1．山東大學(xué)藥學(xué)院，山東濟南250012;2．山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南250101;3．山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東濟南250100)

鹽酸氨溴索，化學(xué)名為反式-4-［2-氨基-3，5-二溴芐基)-氨基］環(huán)己醇鹽酸鹽，是常用的祛痰藥，1991年在我國上市［1，2］。鹽酸氨溴索可以溶解痰液，潤滑呼吸道，并促進肺表面活性物質(zhì)的分泌和纖毛運動，臨床上用于治療支氣管哮喘和慢性支氣管炎［3－5］。有報道［6］表明氨溴索具有葡糖基神經(jīng)酰胺酶活性和減少細胞中氧化應(yīng)激標志物的作用，顯示氨溴索可能具有治療帕金森癥的潛力。

現(xiàn)有的鹽酸氨溴索的生物分析方法包括液相色譜法［7，8］、毛細管電泳法［9］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［10－18］等。生物樣品分析具有取樣量少、分析物濃度低以及含內(nèi)源性物質(zhì)干擾的特點［19］。因此，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以其選擇性好、靈敏度與準確度高、前處理方法簡單的優(yōu)勢成為最為常用的分析鹽酸氨溴索生物樣品的方法。但是現(xiàn)有的方法仍存樣品前處理過程復(fù)雜［10－12］、檢測時間長［13，14］、血漿用量大［11，13，15－17］等問題。例如王國才等［15］采用液相色譜-質(zhì)譜法測定氨溴索的血藥濃度，血漿用量為100 μL，對臨床采血量要求較高，降低了臨床依從性。因此，有必要開發(fā)一種血漿用量少、快速、靈敏且前處理簡單的新方法，以滿足人血漿中鹽酸氨溴索定量分析的需求。

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)測定人血漿中鹽酸氨溴索含量的方法。該方法快速、靈敏，血漿用量少。將該法用于6名健康受試者的生物等效性預(yù)試驗，可為正式生物等效性試驗提供數(shù)據(jù)參考。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

Triple Quad 5500超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)(美國AB SCIEX公司)，配有Analyst 1.6.2積分軟件;3K15臺式高速冷凍離心機(德國Sigma公司);MDF-U5412N醫(yī)用低溫箱(日本松下公司);Milli-Q Advantage A10超純水器(美國 Millipore公司)。

鹽酸氨溴索標準品(純度＞99.0%，中國食品藥品檢定研究院);鹽酸氨溴索-d5標準品(純度100%，加拿大 TLC 公司);甲醇、甲酸、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(色譜純，德國默克公司)。受試制劑:鹽酸氨溴索分散片(規(guī)格:30 mg，批號:1724284，煙臺東誠大洋制藥有限公司);參比制劑:鹽酸氨溴索片(商品名Surbronc Expectorant，規(guī)格:30 mg，批 號:161853，德 國 Boehringer Ingelheim制藥有限公司)。

1．2 標準溶液的配制

準確稱取鹽酸氨溴索標準品10.50 mg，用10.48 mL DMF溶解，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標準品儲備液，于－20℃冰箱中保存。準確移取適量標準品儲備液，用50%(v/v)甲醇水溶液稀釋并配制成適當(dāng)濃度的標準工作液。準確稱取鹽酸氨溴索-d5標準品 10.17 mg，用 10.17 mL DMF溶解，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的內(nèi)標儲備液，再用50%(v/v)甲醇水稀釋至25 ng/mL，作為內(nèi)標工作溶液，于－20℃冰箱中保存。

1．3 樣品前處理

精密移取50 μL血漿樣品，加入50 μL內(nèi)標工作溶液后，加入400 μL甲醇沉淀蛋白質(zhì)，渦旋5 min，于4℃以14 000 r/min離心10 min，取上清液，待分析。

1．4 對照樣品的制備

對照1:取空白血漿380 μL，分別加入鹽酸氨溴索標準溶液 20 μL，配制成含4.0、150.0和 300.0 ng/mL鹽酸氨溴索的血漿樣品，按1.3節(jié)描述處理;對照2:將空白血漿按1.3節(jié)描述處理后，配制含鹽酸氨溴索4.0、150.0和300.0 ng/mL的基質(zhì)樣品;對照3:含4.0、150.0和300.0 ng/mL鹽酸氨溴索的50%(v/v)甲醇水溶液。

1．5 分析條件

1．5．1 色譜條件

色譜柱:XBridge BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，2.5 μm);柱溫:40 ℃;流動相:(A)0.1%(v/v)甲酸水溶液和(B)含0.1%(v/v)甲酸的甲醇溶液;流速:0.4 mL/min;進樣量:2 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1．5．2 質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧電離(ESI)源，正離子模式;離子源溫度:500℃;檢測模式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;離子化電壓:5 500 V;入口電壓(EP):10 V;碰撞室出口電壓(CXP):19 V。鹽酸氨溴索:監(jiān)測離子對，379.0/263.8;碰撞能量(CE)，25 V;去簇電壓(DP)，70 V。鹽酸氨溴索-d5:監(jiān)測離子對，m/z 384.0/263.8;CE，30 V;DP，110 V。

1．6 臨床試驗方案

篩選6名健康成年受試者，身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為19～26 kg/m2，無病史，且體格檢查、心電圖、胸片、實驗室項目及其他相關(guān)檢查均正?；驘o臨床意義的異常。受試者均自愿參加本次臨床試驗，理解研究程序且已簽署知情同意書。

采用單劑量雙周期雙順序交叉試驗設(shè)計，6名受試者隨機分為兩組。第Ⅰ周期，3名受試者進食高熱量、高脂餐后，口服受試制劑鹽酸氨溴索分散片30 mg，另3名受試者進食高熱量、高脂餐后，口服參比制劑鹽酸氨溴索片30 mg，7天后交叉給藥進行第Ⅱ周期研究。

兩周期試驗分別于給藥前(0 h)和給藥后0.33、0.67、1.0、1.33、1.67、2.0、2.33、2.67、3.0、4.0、5.0、7.0、8.0、10.0、12.0、24.0 和 48.0 h 采集靜脈全血4 mL，置于預(yù)冷的乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管中，于4℃以3 000 r/min離心10 min，所得血漿樣品儲存于－60℃超低溫冰箱中，用于測定血漿中鹽酸氨溴索的含量。

1．7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

使用DAS 2.0軟件處理血藥濃度數(shù)據(jù)并計算藥動學(xué)參數(shù)，使用Winonlin 6.2軟件進行統(tǒng)計分析。主要藥動學(xué)參數(shù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后以多因素方差分析(ANOVA)進行顯著性檢驗，然后用雙向單側(cè)t檢驗和計算90%置信區(qū)間的統(tǒng)計方法評價和判斷受試制劑和參比制劑之間的生物等效性。

2 結(jié)果與討論

2．1 方法學(xué)考察

2．1．1 標準曲線

取空白血漿190 μL，加入10 μL不同濃度的鹽酸氨溴索標準溶液，使樣品中鹽酸氨溴索的質(zhì)量濃度分別為 2.0、6.0、20.0、50.0、100.0、200.0、320.0和400.0 ng/mL，按1.3節(jié)所述進行樣品前處理，經(jīng)UHPLC-MS/MS方法測定。采用Analyst軟件自動積分，回歸方程以鹽酸氨溴索與鹽酸氨溴索-d5的色譜峰面積之比為縱坐標(y)，以血漿中分析物的質(zhì)量濃度為橫坐標(x，ng/mL)，采用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法，得到的標準曲線為y=0.049 4x+0.007(n=8)，其相關(guān)系數(shù)(r)為0.998，相對標準偏差(RSD)均在規(guī)定范圍之內(nèi)，說明鹽酸氨溴索在2.0～400.0 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，據(jù)此計算得到的藥物濃度準確可靠。

定量限為標準曲線的最低點，并滿足信噪比S/N＞10。圖1a為鹽酸氨溴索在定量限(2 ng/mL)水平下的選擇離子色譜圖，鹽酸氨溴索的保留時間為1.30 min，鹽酸氨溴索-d5的保留時間為1.29 min，并得到較好的峰形與響應(yīng)值。圖1b為空白血漿樣品的色譜圖，并與圖1a進行比較，發(fā)現(xiàn)空白血漿樣品的色譜圖中沒有干擾峰出現(xiàn)，說明方法對分析物及內(nèi)標的定量沒有影響。圖1c為受試者服用氨溴索4 h后的血漿樣品提取離子色譜圖，結(jié)果表明該方法在用于實際血漿樣品測定時，保留時間沒有發(fā)生漂移。

2．1．2 準確度與精密度

配制含鹽酸氨溴索定量限(2.0 ng/mL)和低、中、高(4.0、150.0、300.0 ng/mL)水平的質(zhì)控樣品各6份，按1.3節(jié)描述進行前處理并測定了3個分析批，考察批內(nèi)、批間準確度和精密度。結(jié)果顯示，4個水平的質(zhì)控樣品批內(nèi)準確度為97.1%～108.7%，批間準確度為99.0%～106.9%;批內(nèi)精密度為1.0%～5.6%，批間精密度為3.7%～5.1%(見表2)。表明該方法準確度和精密度均良好。

圖1 (a)加標(2 ng/mL)血漿樣品、(b)空白血漿樣品和(c)受試者服用氨溴索4 h后血漿樣品的提取離子色譜圖Fig．1 Extract ion chromatograms of(a)a spiked plasma sample(2 ng/mL)，(b)a blank plasma sample and(c)a plasma sample after administration of ambroxol hydrochloride tablets for 4 h

表2 鹽酸氨溴索在不同加標水平下的準確度與精密度Table 2 Accuracies and precisions of the ambroxol hydrochloride under different spiked levels

2．1．3 選擇性、基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

選擇6批來自不同受試者的空白基質(zhì)，分別配制成空白基質(zhì)樣品以及定量限水平的樣品。其中，空白基質(zhì)樣品中干擾組分的響應(yīng)強度均低于分析物定量限響應(yīng)強度的3%，并低于內(nèi)標響應(yīng)強度的1%。說明該方法具有較好的選擇性，能夠區(qū)分分析物和內(nèi)標與基質(zhì)中的干擾組分。

基質(zhì)效應(yīng)的考察通過計算基質(zhì)因子來評價?；|(zhì)因子為基質(zhì)存在下目標物的響應(yīng)峰面積與純?nèi)芤褐心繕宋镯憫?yīng)峰面積的比值，即對照2樣品與對照3樣品中鹽酸氨溴索峰的面積之比。計算得到分析物的基質(zhì)因子為95.4%，說明該方法的基質(zhì)效應(yīng)不影響鹽酸氨溴索的定量分析。

實驗考察分析物在低、中、高3個水平下的提取回收率，結(jié)果分別為98.0%、98.3%和99.3%，內(nèi)標的提取回收率為97.1%。說明該方法回收率較高，結(jié)果較為準確。

2．1．4 穩(wěn)定性

考察了不同條件下放置的樣品中氨溴索的含量，包括儲備液和工作溶液室溫放置12 h、血漿樣本5次凍融循環(huán)、處理過的樣品在室溫放置6 h及在自動進樣器中放置24 h，并計算其與新鮮制備樣品中氨溴索含量的比值，分別為101.2%、106.3%、98.2%、93.6%和103.8%，表明鹽酸氨溴索在上述條件下均能保持穩(wěn)定。

2．2 血漿中的鹽酸氨溴索的測定

采用本文方法測定6名受試者口服受試制劑及參比制劑后的血藥濃度，以時間為橫坐標、測定的血藥濃度為縱坐標，分別繪制受試制劑及參比制劑的鹽酸氨溴索血藥濃度-時間曲線(見圖2)。

圖2 受試者單劑量口服鹽酸氨溴索片的血藥濃度-時間曲線(n=6)Fig．2 Plasma concentration-time curves of ambroxol hydrochloride tablets in subjects after a single oral dose(n=6)

用DAS 2.0軟件計算兩種鹽酸氨溴索片劑的藥動學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表3。由血藥濃度-時間曲線下面積(AUC0－t、AUC0－∞)計算出每個受試者的相對生物利用度，結(jié)果受試制劑對參比制劑的相對生物利用度為(102.3±14.8)%。將 AUC0－t、AUC0－∞和最大血藥濃度經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后，采用雙向單側(cè)t檢驗及90%置信區(qū)間法評價兩種片劑的生物等效性。受試制劑的 AUC0－t、AUC0－∞和 Cmax的 90%置信區(qū)間分別為參比制劑相應(yīng)參數(shù)的91.2%～115.5%、91.1%～115.6%、88.1%～116.9%，均在80.0%～125.0%范圍內(nèi)。結(jié)果表明，本研究中鹽酸氨溴索受試制劑和參比制劑在人體內(nèi)的吸收速度和程度無顯著性差異，具有生物等效性。

表3 受試制劑與參比制劑的主要藥動學(xué)參數(shù)比較(n=6)Table 3 Comparison of main pharmacokinetic parameters of test preparation with reference preparation(n=6)

3 結(jié)論

本文建立了UHPLC-MS/MS測定人血漿中鹽酸氨溴索含量的方法，并應(yīng)用于人體生物等效性預(yù)試驗。該方法具有靈敏度高、選擇性好、基質(zhì)效應(yīng)小的優(yōu)點。在試驗過程中，受試者均未有臨床意義的藥物不良反應(yīng)出現(xiàn)。本試驗為鹽酸氨溴索分散片的生物等效性研究提供了數(shù)據(jù)參考，為正式試驗奠定了基礎(chǔ)。