環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對(duì)金魚(yú)性腺組織學(xué)影響

王菊，高廣斌，曹信瑜，潘方艷，宋元照，王曉強(qiáng)，劉少貞

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

“環(huán)境激素”一詞最早是由美國(guó)《波士頓環(huán)境》報(bào)記者安·達(dá)瑪諾斯基所著《被偷去的未來(lái)》一書(shū)中提出，英語(yǔ)稱為“Endocrine Disrupting Chemicals”(簡(jiǎn)稱“EDCs”)，被譯為“環(huán)境內(nèi)分泌干擾物”[1]。近年來(lái)，在繼臭氧層破壞、全球變暖之后，已成為全球第三大環(huán)境污染問(wèn)題，被許多國(guó)家和國(guó)際組織關(guān)注[2]。它具有與生物內(nèi)分泌激素作用類似的物質(zhì)，如果進(jìn)入動(dòng)物和人體內(nèi)，會(huì)起著類似于內(nèi)分泌腺所分泌的激素的作用，擾亂體內(nèi)激素的正常分泌，進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)物的生理程序發(fā)生紊亂[3]。環(huán)境激素具有種類繁多、來(lái)源廣泛、長(zhǎng)期生產(chǎn)、狀態(tài)多樣、生物富集等特點(diǎn)[4]。

17α-甲基睪酮(17α-Methyltesto-sterone，MT)是一種人工合成的類固醇激素[5]，被大量用于養(yǎng)殖業(yè)。水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用MT來(lái)影響魚(yú)類的性腺分化，以獲得大量雄魚(yú)，加快生長(zhǎng)[6]；在觀賞魚(yú)養(yǎng)殖中也被用來(lái)改善觀賞魚(yú)的體色[7]。動(dòng)物試驗(yàn)表明，10 μg·g-1的甲基睪酮對(duì)3月齡的紅劍尾魚(yú)的性逆轉(zhuǎn)和體色影響顯著[8]，而90 μg·g-1的甲基睪酮對(duì)加快黃鱔的性逆轉(zhuǎn)效果顯著[9]。乙炔雌二醇(Ethinylestradiol, EE2)是雌激素干擾物中的一個(gè)典型代表[10]，同時(shí)也是最具代表性的天然雌激素。其化學(xué)名稱為：1,3,5-(10)-三烯-3β，化學(xué)式為C18H24O2，易溶于乙醇，可溶于丙酮、氯仿等，微溶于植物油，幾乎不溶于水。有試驗(yàn)表明，EE2會(huì)推遲斑馬魚(yú)胚胎的發(fā)育，使斑馬魚(yú)胚胎畸形(體軸彎曲、心包水腫及色素沉著)甚至死亡[11]。來(lái)曲唑(Letorzole，LE)是新一代的芳香化酶抑制劑[12]，屬于人工合成條件下的芐三唑類衍生物。有研究表明，芳香化酶可以選擇性催化雌激素合成的最后一步，而對(duì)于芳香化酶的有效抑制，可以在對(duì)其它甾體激素的生物合成不產(chǎn)生任何影響的情況下，專門(mén)降低雌激素的水平，從而影響卵巢的發(fā)育[13]。來(lái)曲唑在療效、經(jīng)濟(jì)學(xué)一級(jí)安全性上的優(yōu)越性已經(jīng)為多項(xiàng)臨床研究所證實(shí)。還有研究顯示，來(lái)曲唑在抑制雌激素的同時(shí)，可以導(dǎo)致雄激素在體內(nèi)的含量升高，即間接抑制了雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化[14]。

金魚(yú)(Carassiusauratus)作為一種極為常見(jiàn)的觀賞魚(yú)，有很多優(yōu)勢(shì)[15]。我國(guó)以鯉科魚(yú)類為主，選用金魚(yú)更具有代表性，它個(gè)體較小，易于繁殖和飼養(yǎng)，對(duì)水環(huán)境敏感，水中污染物達(dá)到一定程度就會(huì)引起中毒反應(yīng)，滿足了普通生物學(xué)試驗(yàn)的研究需要和試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析的基本需求。本次試驗(yàn)以激素為藥物暴露未性成熟魚(yú)，通過(guò)觀察金魚(yú)精巢和卵巢形態(tài)學(xué)變化、對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，探討3種環(huán)境激素對(duì)金魚(yú)性腺的影響，為環(huán)境激素對(duì)水生生物的影響提供更多的理論基礎(chǔ)，也為尋找環(huán)境監(jiān)測(cè)的敏感水生生物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

金魚(yú)購(gòu)自山西省晉中市太谷縣花鳥(niǎo)魚(yú)蟲(chóng)市場(chǎng)，同一批3月齡幼魚(yú)。在試驗(yàn)室飼養(yǎng)馴化7 d，使其適應(yīng)試驗(yàn)室的物理環(huán)境后，選取體型勻稱且體表無(wú)明顯的機(jī)械損傷、人為損傷，有活力的健康個(gè)體作為試驗(yàn)材料。試驗(yàn)所用的金魚(yú)體長(zhǎng)為(4.39±0.5)cm，體重為(2.35±0.35)g。

1.2 試驗(yàn)試劑及儀器

17α-甲基睪酮藥劑，乙炔雌二醇藥劑，來(lái)曲唑藥劑，冰醋酸、苦味酸、無(wú)水乙醇、二甲苯等試劑，顯微鏡成像系統(tǒng)(RCH1-NK50i)，石蠟切片機(jī)(LeicaRM2245)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)3組處理組，依據(jù)不同化學(xué)藥品的各自屬性以及前人的研究設(shè)置合理的濃度梯度[14]，以及一個(gè)(0.001%(v/v))無(wú)水乙醇溶劑作為對(duì)照組。對(duì)照組與各試驗(yàn)組均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每組10尾金魚(yú)。每天定時(shí)定量的投放飼料，對(duì)試驗(yàn)魚(yú)的健康狀況及活力進(jìn)行觀察記錄，及時(shí)將各組魚(yú)缸中已死亡的試驗(yàn)魚(yú)撈出。使水溫保持恒定在(25±1)℃范圍內(nèi)，光周期14 h∶10 h，半靜水暴露，每天定時(shí)換水，使用充氣泵增氧以保持水中的容氧量。

1.4 取樣及生物學(xué)指標(biāo)測(cè)定

金魚(yú)經(jīng)過(guò)激素處理后，對(duì)對(duì)照組和處理組的金魚(yú)進(jìn)行解剖及組織取樣。每次從魚(yú)缸中隨機(jī)地?fù)迫?尾魚(yú)，將其體表的水分用吸水紙吸干，然后測(cè)量其體長(zhǎng)、體重，同時(shí)做好記錄，隨后迅速摘取其性腺進(jìn)行稱重記錄，快速置于Bouin’s固定液中固定備用。

其中性腺指數(shù)(GSI)的計(jì)算公式為：性腺指數(shù)=[性腺重(g)/體重(g)]×100%。

1.5 石蠟切片的制作

金魚(yú)的性腺首先用波恩氏液固定48 h，將用紗布包裹的組織自來(lái)水沖洗12～24 h后，使用95%，85%，75%梯度濃度的乙醇脫水，用二甲苯透明；經(jīng)過(guò)軟蠟(熔點(diǎn)為54～56 ℃)和硬蠟(熔點(diǎn)為56～58 ℃)進(jìn)行組織浸蠟，然后用硬蠟包埋，蠟塊過(guò)夜使其充分凝固后進(jìn)行蠟塊的修理，切片，制成6組織連續(xù)的蠟帶，在蒸餾水中進(jìn)行展片、貼片、烘箱里進(jìn)行烘片后使用蘇木精-伊紅(H-E) 染色，中性樹(shù)膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 數(shù)據(jù)處理

性腺指數(shù)采用：平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的形式表示。利用spss統(tǒng)計(jì)軟件中的T檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 17α-甲基睪酮對(duì)金魚(yú)性腺組織學(xué)的影響

2.1.1 生物學(xué)指標(biāo)變化

由表1可見(jiàn)，金魚(yú)在不同濃度的MT中暴露3 d時(shí)，雄性處理組未發(fā)生顯著變化，雌性200 ng·L-1處理組的體重顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。暴露7 d時(shí)，雌性處理組與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化，雄性200 ng·L-1處理組的體長(zhǎng)和體重顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。而對(duì)于金魚(yú)的性腺指數(shù)而言，MT處理組與對(duì)照組相比，并沒(méi)有發(fā)生顯著變化。

注: 表中的數(shù)據(jù)均以mean ± SD的形式進(jìn)行顯示，星號(hào)(*)代表與對(duì)照組之間存在顯著差異(P< 0.05;)，其中向上的箭頭(↑)表示平均值升高，向下的箭頭(↓)表示平均值降低，沒(méi)有箭頭和星號(hào)的數(shù)據(jù)表示與對(duì)照組無(wú)顯著的差異。

Note: The data in the table are all shown as mean ± SD. The asterisk (*) represents a significant difference from the control groups (P< 0.05;), with the upward arrow (↑) indicating the average increase and the downward arrow(↓) indicating the average decreases, the data with arrows and asterisks indicate no significant difference from the control groups.

2.1.2 性腺組織學(xué)的變化

經(jīng)過(guò)3 d、7 d的MT暴露后摘取未性成熟的金魚(yú)性腺制作切片，H-E染色后進(jìn)行性腺的組織學(xué)觀察。摘取得到的性腺大多為精巢，少部分為卵巢。經(jīng)觀察，對(duì)照組的金魚(yú)卵巢發(fā)育良好，初級(jí)卵母細(xì)胞(Poc)和次級(jí)卵母細(xì)胞(Coc)在整個(gè)卵細(xì)胞中所占比例正常(圖1-1A，2A)；暴露3 d的50 ng· L-1處理組初級(jí)卵母細(xì)胞(Poc)和次級(jí)卵母細(xì)胞(Coc)所占比例未發(fā)生顯著變化(圖1-1B)，7 d處理組初級(jí)卵母細(xì)胞(Poc)的數(shù)量略有所增多(圖1-2B)；在100 ng·L-1中暴露3 d的處理組初級(jí)卵母細(xì)胞(Poc)所占比例未發(fā)生顯著變化(圖1-1C)，7 d處理組未成熟的卵細(xì)胞(Poc和Coc)比例明顯增多(圖1-2C)；暴露3、7 d的200 ng·L-1處理組中觀察到初級(jí)卵母細(xì)胞(Poc)和次級(jí)卵母細(xì)胞(Coc)數(shù)量均明顯增多(圖1-1D，2D)。對(duì)照組的金魚(yú)精巢發(fā)育良好，成熟精子(SZ)和次級(jí)精母細(xì)胞(S)在細(xì)胞中均存在且所占比例正常(圖1-1E，2E)，暴露3、7 d的處理組在50 ng·L-1時(shí)成熟精子(SZ)所占比例未發(fā)生太大變化，但是7 d時(shí)出現(xiàn)了細(xì)胞空泡化(V)的現(xiàn)象(圖1-1F)；暴露3、7 d的100 ng·L-1處理組中成熟精子(SZ)所占比例均有所減少，未成熟的精細(xì)胞(S)比例有所增多(圖1-1G，2G)，在7 d中依然可以觀察到空泡化(V)的存在；在200 ng·L-1的處理組中成熟精子(SZ)接近于無(wú)，次級(jí)精母細(xì)胞(S)的比例大大增加(圖1-1H，2H)，3 d處理組出現(xiàn)了細(xì)胞空泡化(V)的現(xiàn)象(圖1-1H)。

圖1 MT暴露后的性腺組織學(xué)觀察Fig.1 Photomicrographs of transverse ovary sections of G. rarus unexposed and exposed to MT 注：H-E染色，標(biāo)尺為150 μm，1 A、2A為對(duì)照組卵巢；1B和2B、1C和2C、1D和2D分別為50、100、200 ng·L-1的MT暴露3、7 d的卵巢；1E、2E為對(duì)照組精巢；1F和2F、1G和2G、1H和2H分別為50、100、200 ng·L-1的MT暴露3、7 d的精巢。Poc為初級(jí)卵母細(xì)胞，Coc為次級(jí)卵母細(xì)胞(卵黃前期卵細(xì)胞)；SZ為成熟精子，S為次級(jí)精母細(xì)胞，V為空泡化。 Note：Hemotoxylin and eosin stain, Scale bars, 150 μm,1A and 2 A,the ovary of control female fish; 1B and 2B, 1C and 2C, 1D and 2D while the days are 3 and 7days,the ovary of the concentration of MT is 50, 100, 200 ng·L-1;1E and 2E,the ovary of control male fish; 1F and 2F, 1G and 2G, 1H and 2H while the days are 3and 7days, the ovary of the concentration of MT is 50, 100, 200 ng·L-1.Poc,perinucleolar oocyte, Coc,cortical alveolus stage; SZ, spermatozoa; S, spermatocyte; V, vacuolation.

2.2 乙炔雌二醇對(duì)金魚(yú)性腺組織學(xué)的影響

2.2.1 乙炔雌二醇對(duì)金魚(yú)性腺組織學(xué)的影響生物學(xué)指標(biāo)變化

表2是分別以0、50、100、200 ng·L-1的 EE2處理金魚(yú)3、7 d后，不同性別的金魚(yú)的體長(zhǎng)、體重及性腺重的結(jié)果。不同EE2濃度處理的雄性金魚(yú)體重和性腺重均受到了抑制，50 ng·L-1的EE2 處理金魚(yú)7 d后，變化差異最為明顯。不同EE2濃度處理的雌性金魚(yú)體重和性腺重均受到了促進(jìn)，100 ng·L-1的EE2 處理雌性金魚(yú)后，變化差異最為明顯。

表2 EE2不同暴露時(shí)間金魚(yú)的相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 2 EE2 different exposure time of G. rarus related biological indicators measured results

注: 表中的數(shù)據(jù)均以mean ± SD的形式進(jìn)行顯示，星號(hào)(*)代表與對(duì)照組之間存在顯著差異(P< 0.05;)，其中向上的箭頭(↑)表示平均值升高，向下的箭頭(↓)表示平均值降低，沒(méi)有箭頭和星號(hào)的數(shù)據(jù)表示與對(duì)照組無(wú)顯著的差異。

Note: The data in the table are all shown as mean ± SD. The asterisk (*) represents a significant difference from the control groups (P< 0.05;), with the upward arrow (↑) indicating the average increase and the downward arrow(↓) indicating the average decreases, the data with arrows and asterisks indicate no significant difference from the control groups.

2.2.2 性腺組織學(xué)變化

乙炔雌二醇暴露雌性金魚(yú)3、7 d，從石蠟切片結(jié)果可以看出，對(duì)照組中的金魚(yú)卵巢發(fā)育良好，在整個(gè)卵巢細(xì)胞中有正常數(shù)量的初級(jí)卵母細(xì)胞(Poc)和次級(jí)卵母細(xì)胞(Coc)存在(圖2-1A，2A)，50 ng·L-1的 EE2處理3、7 d的試驗(yàn)組，未成熟卵細(xì)胞(Poc和Coc)的比例略有所增加，未發(fā)生顯著變化(圖2-1B，2B)；在濃度為100 ng·L-1的 EE2 暴露3 d后，金魚(yú)卵巢里未成熟卵細(xì)胞(Poc和Coc)數(shù)量有所增加(圖2-1C)，暴露7 d后的處理組未成熟卵細(xì)胞(Poc和Coc)數(shù)量顯著增加，尤其是初級(jí)卵母細(xì)胞(Poc)(圖2-2C)；當(dāng)EE2的使用濃度達(dá)到 200 ng·L-1時(shí)，卵巢中初級(jí)卵母細(xì)胞(Poc)占整個(gè)卵巢細(xì)胞的比例最大(圖2-1D，2D)，幾乎觀察不到次級(jí)卵母細(xì)胞(Coc)。在濃度分別為0、50、100和200 ng·L-1的EE2暴露 3、7 d精巢中可以觀察到成熟精子數(shù)量明顯下降(圖2-1E-1H，2E-2H)，對(duì)照組的金魚(yú)精巢發(fā)育良好，成熟精子(SZ)和次級(jí)精母細(xì)胞(S)在精細(xì)胞中均存在且所占比例正常(圖2-1E，2E)；暴露3、7 d的處理組在50 ng·L-1時(shí)成熟精子(SZ)所占比例有所減少，未成熟的精細(xì)胞(S)比例有所增多(圖2-1F，2F)；在100 ng·L-1中成熟精子(SZ)所占比例明顯減少，均且出現(xiàn)了細(xì)胞空泡化(V)的現(xiàn)象(圖2-1G，2G)，暴露7 d時(shí)現(xiàn)象尤其明顯；在200 ng·L-1中成熟精子(SZ)接近于無(wú)，次級(jí)精母細(xì)胞(S)的比例大大增加，暴露7 d依然可以觀察到空泡化(V)的存在(圖2-2H)。

2.3 來(lái)曲唑?qū)痿~(yú)性腺組織學(xué)的影響

2.3.1 生物學(xué)指標(biāo)變化

如表3數(shù)據(jù)所示，0、100、200、400 ng·L-1的來(lái)曲唑處理金魚(yú)性腺組織7、14 d后，對(duì)于卵巢來(lái)說(shuō)，與對(duì)照組相比，各濃度的性腺指數(shù)均減少。暴露7 d后，100 ng·L-1的處理組性腺重與性腺指數(shù)顯著下降，400 ng·L-1處理時(shí)體重有所下降，暴露14 d后體重與性腺重沒(méi)發(fā)生顯著變化，僅在200 ng·L-1處理時(shí)性腺指數(shù)有所下降。由此可以表明，LE對(duì)于雌魚(yú)的卵巢的分化具有抑制作用，并且在100 ng·L-1處理時(shí)，抑制作用最為明顯。對(duì)于精巢的處理中，觀察到在一定濃度范圍內(nèi)性腺指數(shù)與對(duì)照組相比增加的情況，暴露7 d后，200 ng·L-1的試驗(yàn)組性腺重與性腺指數(shù)顯著上升，400 ng·L-1處理時(shí)體重顯著上升，暴露14 d后體重與性腺重沒(méi)發(fā)生顯著變化，僅在400 ng·L-1處理時(shí)性腺指數(shù)有所上升，說(shuō)明一定濃度的來(lái)曲唑可以促進(jìn)精巢發(fā)育，在中等濃度200 ng·L-1時(shí)促進(jìn)作用最為明顯。

2.3.2 性腺組織學(xué)的變化

如圖所示，0、100、200、400 ng·L-1來(lái)曲唑處理雌魚(yú)卵巢7、14 d，可以看出，對(duì)照組中金魚(yú)卵巢發(fā)育正常，存在比例正常的初級(jí)卵母細(xì)胞(Poc)和次級(jí)卵母細(xì)胞(Coc)(圖3-1A，2A)；在濃度為100 ng·L-1，暴露7 d的金魚(yú)卵巢初級(jí)卵母細(xì)胞的數(shù)量略微增多(Poc)，次級(jí)卵母細(xì)胞(Coc)數(shù)量略微下降(圖3-1B)，暴露14 d的處理組初級(jí)卵母細(xì)胞的數(shù)量顯著增多(Poc)(圖3-2B)；在200 ng·L-1時(shí)，暴露7 d的處理組則可以明顯的看到次級(jí)卵母細(xì)胞(Coc)的數(shù)量接近于無(wú)，而初級(jí)卵母細(xì)胞(Poc)的數(shù)量大量增加(圖3-1C)，暴露14 d的處理組與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化(圖3-2C)；暴露7、14 d的處理組，400 ng·L-1處理組與200 ng·L-1處理組相比則無(wú)明顯變化(圖3-1D，2D)，由此可以得出，在金魚(yú)的卵巢的分化過(guò)程中，LE的存在對(duì)于卵巢的發(fā)育有抑制作用，200 ng· L-1時(shí)對(duì)于金魚(yú)的卵巢發(fā)育的抑制作用最顯著，LE對(duì)于卵巢的抑制作用不隨濃度的升高呈線性變化。對(duì)照組中精巢發(fā)育正常，存在大量的成熟精子(SZ)(圖3-1E，2E)，成熟精子(SZ)的數(shù)量與未成熟精子(S)的數(shù)量比例正常；暴露7 d后100 ng·L-1的處理組出現(xiàn)了空泡化現(xiàn)象(V)(圖3-1F)，暴露14 d后，成熟精子(SZ)的數(shù)量有所下降(圖3-2F)；暴露7 d后200 ng·L-1處理組中成熟精子含量大大增加(圖3-1G)，處理14 d后，處理組中成熟精子含量也明顯增加(圖3-2G)；而400 ng·L-1處理組與200 ng·L-1處理組相比，精子含量增加并不明顯(圖3-1H，2H)。由此可以得出，來(lái)曲唑LE 對(duì)于金魚(yú)精巢的分化具有促進(jìn)作用，并且在200 ng·L-1時(shí)對(duì)于精子的促進(jìn)作用最強(qiáng)。

表3 LE不同暴露時(shí)間金魚(yú)的相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 3 LE exposure time of G. rarus related biological indicators measured results

注: 表中的數(shù)據(jù)均以mean ± SD的形式進(jìn)行顯示，星號(hào)(*)代表與對(duì)照組之間存在顯著差異(P< 0.05;)，其中向上的箭頭(↑)表示平均值升高，向下的箭頭(↓)表示平均值降低，沒(méi)有箭頭和星號(hào)的數(shù)據(jù)表示與對(duì)照組無(wú)顯著的差異。

Note: The data in the table are all shown as mean ± SD. The asterisk (*) represents a significant difference from the control groups (P< 0.05;), with the upward arrow (↑) indicating the average increase and the downward arrow(↓) indicating the average decreases, the data with arrows and asterisks indicate no significant difference from the control groups.

3 討論與結(jié)論

本研究采用3種不同濃度的環(huán)境激素處理未性成熟的金魚(yú)，對(duì)金魚(yú)的體長(zhǎng)、體重及性腺重3項(xiàng)生長(zhǎng)性狀指標(biāo)進(jìn)行測(cè)量及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用光學(xué)顯微鏡觀察處理組與對(duì)照組的性腺組織學(xué)變化，以此研究不同濃度效應(yīng)、時(shí)間效應(yīng)對(duì)金魚(yú)性腺發(fā)育的影響。

試驗(yàn)結(jié)果表明，MT處理金魚(yú)3 d后，金魚(yú)的卵巢及精巢沒(méi)有表現(xiàn)出明顯變化，而在處理7 d后，金魚(yú)的卵巢及卵細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育受到不同程度的影響，隨著MT暴露濃度的增加，受到的影響逐漸加重，這與之前研究麥穗魚(yú)暴露MT后性腺組織學(xué)的研究結(jié)果一致[16]，前人的研究結(jié)果表明：在一定的濃度范圍內(nèi)，MT表現(xiàn)出來(lái)的特征與雄激素的作用類似，在雌性稀有鮈鯽的卵巢中出現(xiàn)了許多成熟的精細(xì)胞，改變了部分稀有鮈鯽的性別[17]，但是本研究沒(méi)有出現(xiàn)這種現(xiàn)象，很可能是由于所選魚(yú)的成熟度、設(shè)置的濃度不同，激素處理時(shí)間太短所致，所以本試驗(yàn)只能觀察到MT在7 d里對(duì)金魚(yú)產(chǎn)生了一定的影響，使卵巢中金魚(yú)未成熟的卵細(xì)胞數(shù)量增多。前人的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MT能使VTG的含量下降[18]，動(dòng)物試驗(yàn)表明，MT能夠?qū)θ毡厩圜F幼魚(yú)、斑馬魚(yú)幼魚(yú)和羅非魚(yú)體內(nèi)卵黃蛋白原(VTG) 產(chǎn)生影響，且MT 能顯著地減少魚(yú)體內(nèi)的 VTG 含量，可以推測(cè)出MT通過(guò)抑制機(jī)體內(nèi)卵黃蛋白原的合成抑制雌性魚(yú)體生殖系統(tǒng)的發(fā)育[19，20]，因此我們推測(cè)，MT是通過(guò)抑制體內(nèi)的卵黃蛋白原的合成來(lái)影響金魚(yú)雌魚(yú)的發(fā)育的。本次試驗(yàn)表明MT對(duì)金魚(yú)的精巢有著一定程度的促進(jìn)作用，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，MT在濃度380 ng·L-1的時(shí)候，青鳉的精巢出現(xiàn)精卵巢現(xiàn)象[21]，本次試驗(yàn)未出現(xiàn)這種情況，很可能是因?yàn)樵O(shè)置的濃度梯度還不太合理，導(dǎo)致結(jié)果并不太明顯。

圖3 LE暴露后的性腺組織學(xué)觀察Fig.3 Photomicrographs of transverse ovary sections of G. rarus unexposed and exposed to LE 注：H-E染色，標(biāo)尺為150 μm，1 A、2A為對(duì)照組卵巢；1B和2B、1C和2C、1D和2D分別為100、200、400 ng·L-1的LE暴露7和14 d的卵巢；1E、2E為對(duì)照組精巢；1F和2F、1G和2G、1H和2H分別為100、200、400 ng·L-1的LE暴露7和14 d的精巢。Poc為初級(jí)卵母細(xì)胞，Coc為次級(jí)卵母細(xì)胞(卵黃前期卵細(xì)胞)；SZ為成熟精子，S為次級(jí)精母細(xì)胞，V為空泡化。Note：Hemotoxylin and eosin stain, Scale bars, 150 μm,1A and 2 A,the ovary of control female fish; 1B and 2B, 1C and 2C, 1D and 2D while the days are 7 and14 d the ovary of the concentration ofLE is 100, 200, 400 ng·L-1;1E and 2E,the ovary of control male fish; 1F and 2F, 1G and 2G, 1H and 2H while the days are 7and 14days the ovary of the concentration of LE is 100, 200, 400 ng·L-1.Poc,perinucleolar oocyte, Coc,cortical alveolus stage; SZ, spermatozoa; S, spermatocyte; V, vacuolation.

試驗(yàn)對(duì)金魚(yú)進(jìn)行為期3、7 d的濃度梯度為0、50、100、200 ng·L-1EE2處理，通過(guò)記錄金魚(yú)處理前后的體長(zhǎng)、體重和性腺重，處理數(shù)據(jù)并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析研究。石蠟切片分析得知，相同暴露時(shí)間下，當(dāng)EE2濃度不斷提高時(shí)，精巢中的精子數(shù)目顯著下降。前人研究顯示，在一定劑量范圍內(nèi)，EE2具有顯著的雌性激素特點(diǎn)，促進(jìn)了雌性中華鱘卵細(xì)胞的發(fā)育成熟，使得機(jī)體內(nèi)成熟卵細(xì)胞占整個(gè)卵巢細(xì)胞的比例提高，初級(jí)卵母細(xì)胞和次級(jí)卵母細(xì)胞所占比例減小[22]，但在本次對(duì)雌性金魚(yú)分別進(jìn)行濃度為0、50、100、200 ng·L-1EE2暴露3、7 d后，在處理組和對(duì)照組的對(duì)比之下整體變化并不明顯，僅在100的 EE2暴露金魚(yú)7 d后性腺重發(fā)生了顯著上升，金魚(yú)的體重在EE2處理組的作用下也沒(méi)有明顯的變化，造成這種結(jié)果的原因可能是有激素處理時(shí)間較短，EE2濃度梯度跨度過(guò)大。

EE2能促進(jìn)合成用于機(jī)體不同組織發(fā)育的DNA、RNA以及生物組織系統(tǒng)內(nèi)需要的多種具有不同作用的蛋白質(zhì)[23]。雌激素治療劑常用于治療女性性腺功能殘缺、雙側(cè)卵巢切除術(shù)后修復(fù)、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、萎縮性陰道炎等[24]。與EE2作用機(jī)制相反，MT是抗雌性激素，在一定的濃度范圍內(nèi)，其具有顯著的雄性激素特點(diǎn)，動(dòng)物試驗(yàn)表明，EE2通過(guò)降低大鼠體內(nèi)γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)的濃度使得GABA對(duì)大鼠分泌促性腺激素(GTH)的刺激作用降低[25]。雌二醇治療劑常用于治療晚期前列腺癌，摘除男性睪丸后再加以雌激素治療，可以顯著緩解癥狀，使得病人的病痛得以減輕[26]。Harikrishnan Thilagam等人的研究表明幼年的成年日本鱸魚(yú)在17β-雌二醇溶液中暴露3 d后，其試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，免疫球蛋白和各種白細(xì)胞的數(shù)目及水平發(fā)生了顯著的上升，證明了17β-雌二醇對(duì)幼年、成年日本鱸魚(yú)的暴露會(huì)引起其免疫應(yīng)答的發(fā)生，并可能對(duì)免疫系統(tǒng)的功能產(chǎn)生一定影響[27]。

本試驗(yàn)中，通過(guò)設(shè)置LE不同濃度、不同時(shí)間對(duì)金魚(yú)的精巢、卵巢組織學(xué)影響以及性腺指數(shù)值分析，可以得到，LE在低濃度100 ng·L-1時(shí)，對(duì)于卵巢分化有明顯的抑制作用，隨著濃度的增加，對(duì)于卵巢作用的整體趨勢(shì)仍然是抑制，但相比在100 ng·L-1時(shí)的抑制作用，卻顯得較弱，且并沒(méi)有很好的體現(xiàn)出時(shí)間的作用效應(yīng)；對(duì)精巢分化而言，LE則有明顯的促進(jìn)作用，可以加快雄性金魚(yú)的精巢的分化，可以應(yīng)用于雄魚(yú)的性腺發(fā)育。在李廣麗等[28]的研究中發(fā)現(xiàn)，來(lái)曲唑作為芳香化酶抑制的一種，對(duì)于卵巢的抑制作用主要是對(duì)于雌激素產(chǎn)生的抑制作用，從而抑制了卵巢的發(fā)育；而對(duì)于精巢的促進(jìn)作用主要是通過(guò)抑制雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化或者時(shí)由于對(duì)于雌激素產(chǎn)生的抑制作用而導(dǎo)致的雄性激素增加，該條件直接刺激原始生殖細(xì)胞的產(chǎn)生和分化，從而加快了精巢分化的進(jìn)程。有研究表明，芳香化酶可以分為腦型芳香化酶和性腺型芳香化酶，這2種酶分別由基因CYP19B和基因CYP19A進(jìn)行編碼[29]，并且，這2種芳香化酶呈特異性表達(dá)。由此，依據(jù)芳香化酶的特異性表達(dá)，可以通過(guò)不同的渠道，控制芳香化酶表達(dá)，從而控制相關(guān)激素的合成，使得激素作用的腺體的分化受到抑制。在非哺乳動(dòng)物中有研究表明，芳香化酶在魚(yú)體中具有控制其性別分化的作用，例如，對(duì)于暗紋東方鲀、硬骨魚(yú)等的研究[30]。在對(duì)于哺乳動(dòng)物的研究中，來(lái)曲唑主要是以補(bǔ)喂的形式研究其對(duì)于哺乳動(dòng)物的影響。在對(duì)公牛的研究中顯示，來(lái)曲唑主要是通過(guò)提高公牛體內(nèi)內(nèi)源性雄激素的含量，降低其雄二醇和雌酮含量，由此可以推測(cè)LE可能通過(guò)抑制金魚(yú)體內(nèi)的雄二醇和雌酮含量來(lái)抑制金魚(yú)性腺的發(fā)育。在對(duì)于老鼠的致癌研究試驗(yàn)中顯示，來(lái)曲唑的藥物作用于雄鼠而言，沒(méi)有較大的作用，但是對(duì)于雌鼠，可以使雌鼠得腫瘤疾病的幾率降低。對(duì)于人類的病例應(yīng)用表明，來(lái)曲唑通過(guò)口服即可吸收和利用，并且起到很好的藥效，與同類的藥物相比，具有對(duì)芳香化酶的高度選擇性、半衰期長(zhǎng)、治療有效率高，對(duì)身體其他部位的副作用小等更多優(yōu)勢(shì)。綜上所述，芳香化酶抑制劑來(lái)曲唑?qū)τ诖启~(yú)卵巢發(fā)育的抑制作用可能是由于抑制了雌激素而導(dǎo)致的，LE的應(yīng)用對(duì)于預(yù)防雌魚(yú)的癌變疾病可能會(huì)有積極作用，具體作用方式及作用條件還有待進(jìn)一步研究，而對(duì)于雄魚(yú)精巢發(fā)育具有促進(jìn)作用，可能是通過(guò)抑制雌激素的產(chǎn)生導(dǎo)致的，LE在雄魚(yú)的應(yīng)用還尚未清楚。

性固醇類激素在魚(yú)類性腺發(fā)育成熟過(guò)程中起著重要作用，1969年，日本學(xué)者Ynla amot和Kjas hiam則首次對(duì)魚(yú)類的性別決定機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)的闡述，總結(jié)了魚(yú)類的性腺類型、雌雄同體的現(xiàn)象、性別決定的遺傳學(xué)基礎(chǔ)以及性固醇類激素對(duì)性別分化的影響，提出類固醇激素是自然的“性誘導(dǎo)劑”，雌激素扮演著“雌性誘導(dǎo)”的角色，雄激素扮演著“雄性誘導(dǎo)”的角色，而國(guó)內(nèi)也有學(xué)者有與此類似的研究報(bào)道[31]?？傊?種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對(duì)金魚(yú)的性腺產(chǎn)生了不同程度的可見(jiàn)影響，本文僅選用2個(gè)不同時(shí)間段內(nèi)暴露的金魚(yú)，并未對(duì)其余更短或更長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)EDCs對(duì)金魚(yú)性腺組織形態(tài)做更深入的研究，同時(shí)由于試驗(yàn)時(shí)間較短并未觀察到生殖細(xì)胞在功能上發(fā)生異常以及深入剖析是否具有遺傳毒性，激素在雌雄金魚(yú)體內(nèi)的機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究和探索。