外泌體的提取、鑒定和保存方法研究進(jìn)展

蒲雙雙

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，濟(jì)南 250011)

外泌體，于1987年由Johnstone等[1]在研究綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，是一種直徑介于40～100nm的囊泡樣結(jié)構(gòu)。在電子顯微鏡下，外泌體由雙層磷脂膜包裹，內(nèi)含豐富的蛋白質(zhì)以及micro RNA等成分，其中一些獨(dú)特的蛋白(如CD9，CD63，CD81，HSP70，TSG101等)還可作為外泌體的特征蛋白，在外泌體提取和鑒定中起重要作用。起初，外泌體被認(rèn)為是細(xì)胞排泄的廢物，但近年來，越來越多的研究表明外泌體參與物質(zhì)運(yùn)輸，還攜帶和傳遞重要的生物信息[2]，在介導(dǎo)免疫抗原遞呈、樹突狀細(xì)胞的活化、神經(jīng)退行性疾病發(fā)生、腫瘤細(xì)胞抗原的轉(zhuǎn)移及腫瘤診斷治療中發(fā)揮重要作用[3～5]。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)等分析手段的發(fā)展，外泌體介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)及其背后的分子機(jī)制將會(huì)更加清晰，但在此研究過程中，外泌體的提取純化、鑒定及合理保存是首要的步驟，也是一切后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，畢竟只有高純度、高活性的外泌體才能確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量和可信度。為此我們對(duì)目前常用的外泌體提取、鑒定和保存的方法及其優(yōu)缺點(diǎn)做如下綜述：

1外泌體提取方法

1.1 超速離心法(差速離心法) 超速離心法是目前制備外泌體的經(jīng)典方法，是根據(jù)外泌體的沉降系數(shù)差速離心將其分離出來。該方法是在4℃條件下依次以300 g，2000 g，10 000 g離心以去除細(xì)胞與細(xì)胞碎片，再以100 000 g超速離心達(dá)到分離、富集外泌體的目的。磷酸緩沖液(PBS)清洗可部分去除殘存蛋白質(zhì)。超速離心法具有操作簡單、不被分離試劑污染、獲得的外泌體數(shù)量較多的優(yōu)點(diǎn)，因此最常用，也被認(rèn)為是外泌體提取純化的金標(biāo)準(zhǔn)。但是超速離心法，需要昂貴的超高速離心機(jī)設(shè)備投入，每次處理的樣本量較小，過程費(fèi)時(shí)，電鏡鑒定時(shí)還發(fā)現(xiàn)外泌體易聚集成塊。研究發(fā)現(xiàn)，超速離心后富集的外泌體中通常含有雜質(zhì)蛋白及凋亡小體、脫落微泡等[6]，純度不高，且上清中仍能檢測到大小介于 30～300 nm之間的囊泡[7]，存在外泌體丟失的現(xiàn)象。此外，也有研究認(rèn)為反復(fù)的高速離心會(huì)導(dǎo)致外泌體破裂，引起成分丟失，影響外泌體質(zhì)量[8]。

1.2 蔗糖密度梯度離心法 外泌體易在1.13～1.19 g/ml密度范圍的蔗糖溶液中富集，基于此特性，可將樣本和蔗糖梯度溶液一起超速離心，外泌體沉降到等密度區(qū)得以分離純化，這就是蔗糖密度梯度離心法。此方法需預(yù)先配好連續(xù)梯度蔗糖溶液，置于離心管底部，樣本鋪在上部，再4℃100 000 g超速離心。蔗糖對(duì)細(xì)胞無毒，粘度不高且pH中性，用該法獲得的外泌體純度也較高，但前期準(zhǔn)備工作過于復(fù)雜，易受離心率外因的影響[9]，所得外泌體中也含有難以去除的高密度化學(xué)物。也有研究提出該法不適合臨床生物標(biāo)志物研究，因?yàn)閺难寮澳蛞褐刑崛⊥饷隗w的純度較低，而僅適用于細(xì)胞培養(yǎng)液中外泌體的提取[10]。

1.3 超濾法 是將溶劑及小分子物質(zhì)過濾到膜的另一側(cè)，而將相對(duì)大分子物質(zhì)截留在超濾膜上，以達(dá)到分離的目的。外泌體直徑范圍40～100 nm，我們用孔徑小于100 nm的超濾膜短時(shí)間低速離心就可以分離樣本中的外泌體。目前超濾法分壓力超濾和離心超濾兩種，一般認(rèn)為離心法較優(yōu)。通常離心力越高、離心時(shí)間越長所得外泌體的濃度越高，但離心力太大，離心時(shí)間太長又會(huì)導(dǎo)致超濾膜破裂，因此適度的離心力和時(shí)間對(duì)于分離成功很重要。也有研究提出，50～200 ml樣本更適合采用離心法，而樣本量大于400 ml時(shí)適合用壓力法[6]。超濾法操作簡單，對(duì)樣本體積要求低，只需低速離心，能大大減少超高速引起的外泌體破裂。但該法需要考慮膜的孔徑范圍，外泌體和大分子蛋白質(zhì)可能粘附堵塞濾孔，影響外泌體提取率和純度[8]。Cheruvanky等[11]先利用納米超濾膜分離得到尿外泌體，后Merchant等[12]換用低蛋白質(zhì)結(jié)合的聚偏氟乙烯膜，減小了尿蛋白干擾，分離到的尿外泌體純度有所提高。

1.4 PEG沉淀法 聚乙二醇(PEG)是一種水溶性非離子化合物，通過競爭結(jié)合水分子，增加疏水性蛋白和脂質(zhì)分子的相互結(jié)合力而沉淀外泌體。Rider等[13]曾用7種不同濃度PEG6000來提取細(xì)胞培養(yǎng)液外泌體，實(shí)驗(yàn)證實(shí)8% PEG6000提取外泌體純度最高。該法是去除細(xì)胞及碎片后，在樣本中加入終濃度為8% PEG 6000混勻，4℃過夜，次日10 000 g離心1 h即可獲得外泌體。據(jù)研究，與超速離心法相比，PEG能更有效沉淀外泌體，陽性分離率高，離心上清中外泌體水平極低。但化學(xué)添加劑是否會(huì)破壞外泌體的生物學(xué)活性還有待探討。

1.5 色譜法 在色譜柱中，大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔，很快沿多孔凝膠間的縫隙被流動(dòng)相洗脫出來；而小分子物質(zhì)能進(jìn)入凝膠孔，被滯留，更慢地被洗脫出來[14]。此法分離到的外泌體純度較高，在電鏡下大小均一，但是獲取量少，所需特殊設(shè)備也限制了其廣泛應(yīng)用。

1.6 免疫磁珠法 免疫磁珠上包被有單克隆抗體，能與外泌體表面特異性抗原結(jié)合，通過增加外泌體的相對(duì)分子量而將其分離出來。4℃條件下，樣本與免疫磁珠共孵育4 h，100 000 g離心1 h得到底層免疫磁珠-外泌體復(fù)合物，蒸餾水或PBS沖洗后，再用甘氨酸-Tris-HCl溶液洗脫即可最后獲得外泌體。該法提取的外泌體特異性最高，但酸性和低滲溶液可能會(huì)影響外泌體的形態(tài)及生物活性。還有免疫磁珠價(jià)格昂貴，不利于普及。

1.7 試劑盒提取法 近年出現(xiàn)了各種用于分離純化外泌體的商品化試劑盒，有的通過過濾器過濾掉雜質(zhì)成分，有的采用空間排阻色譜法進(jìn)行分離，也有的用沉淀法沉淀外泌體。目前最常用的是由System Biosciences(SBI)研發(fā)的Exo Quick試劑盒，聚合物沉淀劑Exo Quick預(yù)混液與樣本4℃共孵育，使外泌體聚集，第二天1 500 g離心5 min，PBS重懸沉淀即可獲得外泌體。此法僅需簡單混勻和常規(guī)離心即可從少量樣本中獲得豐富的外泌體，簡便快捷、設(shè)備要求低。但沉淀中也含有其他囊泡及大分子雜質(zhì)蛋白，影響外泌體純度。也有報(bào)道提出該法影響外泌體蛋白和mi RNA組分，不利于后續(xù)蛋白組學(xué)和遺傳學(xué)研究[15，16]。

以上各種外泌體分離純化方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，選擇哪種方法應(yīng)根據(jù)樣本類型、樣本量及后續(xù)實(shí)驗(yàn)而定，可以選擇單一方法也可用幾種方法的聯(lián)合。例如李玉靜等[17]就采用蔗糖密度梯度離心聯(lián)合2次PEG6000沉淀的方法，用低廉的提取成本獲得胎盤來源外泌體。王鑫偉等[18]將試劑盒提取的外泌體再經(jīng)過超速離心純化去除雜質(zhì)，獲得了更高純度的外泌體。除了選擇實(shí)驗(yàn)方法，標(biāo)本的前處理也越來越受到重視，尤其是蛋白尿標(biāo)本，其中大量蛋白會(huì)對(duì)外泌體的提取造成很大干擾。Alvarez等[19]在對(duì)商品化試劑Exo Quick提取尿外泌體的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改進(jìn)時(shí)，用還原劑二硫蘇糖醇(DTT)對(duì)尿樣本進(jìn)行前處理，DTT能打開TH蛋白的二硫鍵，減少TH蛋白對(duì)尿外泌體提取的干擾。后Musante等[20]換用3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)對(duì)尿樣本進(jìn)行前處理，據(jù)研究CHAPS比DTT能更好保持蛋白質(zhì)的構(gòu)象和酶活性，有利于外泌體蛋白質(zhì)的后續(xù)功能和活性研究。

另外，酸堿度也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生很大影響，Ban等[21]在提取細(xì)胞培養(yǎng)液中外泌體時(shí)發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下外泌體標(biāo)記蛋白及RNA獲得率較高，而堿性條件下外泌體蛋白質(zhì)及RNA容易被破壞。還有試劑的用量及離心力大小等細(xì)節(jié)也需要在具體實(shí)驗(yàn)中不斷摸索以期達(dá)到最佳效果。Alvarez等[19]發(fā)現(xiàn)，加大Exo Quick分離液的用量及提高離心力，可明顯提高外泌體的純度。

2外泌體鑒定方法用于外泌體鑒定的方法通常有以下幾種，一般會(huì)采用兩到三種方法聯(lián)合鑒定。

2.1 透射電鏡直接觀察外泌體形態(tài) 將新鮮得到的外泌體溶液滴加到100目載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置1 min，然后用磷鎢酸鈉溶液(或乙酸雙氧鈾溶液)滴到銅網(wǎng)上負(fù)染1 min，用濾紙吸去余液，就可將銅網(wǎng)放到透射電鏡下觀察外泌體形態(tài)。

2.2 免疫學(xué)方法 用流式細(xì)胞術(shù)，Western-blot，ELISA等方法檢測外泌體表面特異蛋白CD9，CD63。用過量帶特殊標(biāo)記的單克隆抗體與外泌體特異蛋白抗原結(jié)合，洗去未結(jié)合抗體后，檢測抗原抗體復(fù)合物上的特殊標(biāo)記的量就代表外泌體量。除CD9，CD63外，不同來源外泌體攜有各自母細(xì)胞的特異分子，如樹突狀細(xì)胞來源外泌體攜帶有CD80，CD86[22]，惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞來源外泌體帶有磷脂酰乙醇胺[23]，因此可根據(jù)其不同來源設(shè)計(jì)特異性更高的外泌體鑒定方法。

2.3 PCR或測序方法 分析遺傳物質(zhì)成為目前應(yīng)用越來越廣泛的外泌體鑒定方法。

2.4 其他方法 原子力顯微鏡，能夠測量外泌體的確切尺寸，也可用于抗體標(biāo)記后外泌體的檢測。最近發(fā)展的圖像流技術(shù)直接可視化和特性描述外泌體[24]。

3外泌體的保存Zhou等[25]應(yīng)用PCR法研究不同保存條件下尿液標(biāo)本對(duì)提取外泌體后RNA含量的影響，他從新鮮尿液及-20℃凍存24 h的尿液中以相同方法提取外泌體，檢測比較RNA含量，發(fā)現(xiàn)凍存尿液中提取的外泌體其RNA總量減少了40%。Sokolova等[26]指出保存環(huán)境對(duì)維持外泌體直徑及完整性至關(guān)重要，他對(duì)提取好的臍帶血來源外泌體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，外泌體常溫保存2天直徑下降60%，4℃保存3～4天直徑下降25%，-20℃短期保存直徑無明顯變化，而-80℃條件可長期保存?？傊?，用于提取外泌體的樣本要盡可能新鮮，已提取外泌體要凍存，且用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的外泌體的保存條件必須一致。外泌體能傳遞生物信息，通過多種方式對(duì)細(xì)胞的生理活動(dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié)并與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是近年來研究的一大熱點(diǎn)。外泌體分布廣泛，存在于人體幾乎所有體液和細(xì)胞培養(yǎng)液中，易無創(chuàng)獲取，但是想要提取到純度高活性好的外泌體也頗具挑戰(zhàn)，以上外泌體提取、鑒定和保存的方法及優(yōu)缺點(diǎn)，希望可以為研究者們提供一些參考，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究打好基礎(chǔ)。