蟾蜍類藥材質量研究△

劉美，馮杉，張娟，陳炫好，張生艷，李先寬*

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193；2.北京中醫(yī)藥大學東方學院，河北 廊坊 065001）

蟾蜍類藥材蟾酥、干蟾、蟾衣來源于蟾蜍科動物中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的耳后腺或皮膚腺分泌物、干燥全體及蟾蜍自然脫下的角質衣膜[1-3]。前兩種均為國家藥典或部頒標準收載的藥材，作為抗腫瘤藥物研究和使用的比較多，蟾衣作為一種從民間發(fā)掘的蟾蜍新藥用資源，廣泛用于治療肝癌和消腹水等疾病，且毒性較低。蟾蜍類藥材具有強心、升壓抗休克、抗炎鎮(zhèn)痛、麻醉、抗腫瘤、抗輻射、利尿、增強機體免疫力及改善循環(huán)等多種藥理活性[4，5]。用于瘡癀腫毒、咽喉腫痛、化膿性感染、急慢性炎癥、急救昏迷、心力衰竭等癥[6]，是蟾酥丸、麝香保心丸、六神丸等復方制劑中主要配伍藥材。目前由于蟾蜍類藥材市場需求量不斷增加，吉林、江蘇、山東等省份廣泛分散的蟾蜍養(yǎng)殖沒有形成統(tǒng)一規(guī)范的標準，導致蟾蜍類藥材質量不均，不同來源-野生或養(yǎng)殖、不同生長年限、不同環(huán)境、不同生產加工方法導致藥材質量不均一現(xiàn)象嚴重。本研究以不同產地的蟾蜍類藥材蟾酥、干蟾、蟾衣為研究對象，對不同產地、不同生長年限的蟾蜍類藥材中4種蟾毒配基類成分進行測定，旨在對不同產地蟾蜍類藥材進行質量評價，并嘗試性探索干蟾、蟾衣成分積累與生長年限之間的關系，為蟾蜍規(guī)范化養(yǎng)殖、藥材質量均一化，合理開發(fā)、應用蟾蜍類藥材資源提供理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT型高效液相色譜儀，SPD-20A紫外-可見光檢測器，SIL-20A自動進樣器；Sartorius BT125D電子天平（十萬分之一，賽多利斯科學儀器有限公司）；FA2004電子天平（萬分之一，上海精天電子儀器有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；RE-52AA旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；KDM型調溫電熱套（北京永興精佳儀器有限公司）；KH3200B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

對照品蟾毒靈、酯蟾毒配基、華蟾酥毒基（購自中國食品藥品檢定研究院，含量測定用，批號分別為111981-201501、110718-201108、110803-201406），蟾毒它靈（購自天津萬象恒遠科技有限公司，質量分數(shù)大于98%，批號20180115）。乙腈（色譜純），甲醇（色譜純），磷酸二氫鉀（分析純），磷酸（分析純），水為重蒸餾水。

1.3 藥材

藥材信息見表1，供試樣品1，2于2017年9月購于三棵樹藥材市場，樣品3～6于2017年9月吉林省采集，樣品7～12于2017年10月購于安徽亳州藥材市場，共計12份樣品，經天津中醫(yī)藥大學張堅博士鑒定為蟾酥、干蟾和蟾衣，基原動物為中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor。

表1 蟾蜍類藥材樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為迪馬Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為乙腈（A）-0.5%磷酸二氫鉀溶液（B），磷酸調節(jié)pH為3.2；梯度洗脫，0～15 min，30% ～61%B；15～30 min，61%B；30～32 min，30%B；檢測波長296 nm，流速0.7 mL·min－1，柱溫：30℃，進樣量：20μL?；旌蠘藴势啡芤汉蜆悠啡芤旱膱D譜見圖1。

圖1 蟾蜍藥材對照品及樣品的HPLC色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含蟾毒它靈 0.050 3 mg·mL－1、蟾毒靈0.054 3 mg·mL－1、華蟾酥毒基0.084 mg·mL－1、酯蟾毒配基0.050 1 mg·mL－1的對照品溶液，搖勻，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取蟾酥藥材細粉約25 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定重量，加熱回流1小時，放冷，再稱定重量，甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

取干蟾藥材粉末（過3號篩）2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，加熱回流1小時，過濾，濃縮回收甲醇，濃縮液用甲醇準確定容到5 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

蟾衣藥材細粉0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，加熱回流1小時，過濾，濃縮回收甲醇，濃縮液用甲醇準確定容到5 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關系考察

分別精密吸取 “2.2.1”4個對照品溶液適量，配制成不同濃度的對照品溶液，分別進樣20μL，記錄峰面積，以濃度為橫坐標，以峰面積A為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：蟾毒它靈：Y＝2.290 3X－0.402 6（r＝0.999 9），0.419 2～50.300 0μg·mL－1呈良好的線性關系；蟾毒靈：Y＝3.163 5 X－0.109 8（r＝0.999 9），0.010 8～54.300 0μg·mL－1呈良好的線性關系；華蟾酥毒基：Y＝2.759 6 X－0.6（r＝0.999 7），0.016 7～84.000 0μg·mL－1呈良好的線性關系；酯蟾毒配基：Y＝2.781 5 X－1.050 1（r＝0.999 6），0.009 9～50.100 0μg·mL－1呈良好的線性關系。

2.4 精密度試驗

精確吸取4種對照品溶液各20μL，分別按2.1項下色譜條件測定各對照品峰面積5次積分值的RSD分別為：蟾毒它靈0.74%；蟾毒靈0.52%；華蟾酥毒基0.83%；酯蟾毒配基0.91%。儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取同一樣品溶液在 0、3、5、7、9、12 h分別進樣20μL，依次測定，結果6次測定峰面積的RSD分別為蟾毒它靈1.51%、蟾毒靈1.74%、華蟾酥毒基0.87%、酯蟾毒配基1.05%。結果表明，樣品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.6 重復性試驗

取1號樣品6份，按供試品溶液制備項操作，平行制備6份樣品，按上述色譜條件測定，計算指標成分的平均含量為蟾毒它靈10.492 7 mg·g－1，峰面積RSD＝1.67%（n＝6）；蟾毒靈7.370 7 mg·g－1，RSD＝2.76%（n＝6）；華蟾酥毒基 17.734 7 mg·g－1，RSD＝1.70%（n＝6）；酯蟾毒配基 2.08 mg·g－1，RSD＝1.72%（n＝6）。結果表明，該方法的重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

取1號樣品6份，每份約25 mg，2份為一組，分別精密加入高、中、低三個量的蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基對照品貯備液。按2.2.2項下制備供試品溶液，準確吸取供試品20μL進樣，按2.1項下色譜條件測定，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果

2.8 樣品含量測定

稱取1.3項下一定質量的蟾蜍類藥材，精密稱定，按2.2.2項下制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定。每一樣品進樣3次，以外標法中的標準曲線法計算蟾蜍藥材樣品各成分含量。所得結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（mg·g－1，n＝3）

3 討論

近年研究結果表明，蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基等蟾毒配基類成分在體內外對人肝癌、胃癌、肺癌、腸癌、鼻炎癌、前列腺癌、婦科腫瘤及胰腺癌等多種實體瘤生長均有良好的抑制活性[7-9]，其中華蟾酥毒基還具有治療心血管疾病的藥理作用[10]，同時蟾毒靈對正常細胞也具有一定的細胞毒性[11]。因此，本研究對蟾蜍類藥材——蟾酥、干蟾皮、蟾衣中這四類成分進行了含量測定。4份市售蟾酥藥材中指標成分含量測定結果表明，以華蟾酥毒基和脂蟾毒配基為標準，4份蟾酥藥材樣品華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的總量0.78%～1.99%，均未能滿足2015年版 《中華人民共和國藥典》規(guī)定的質量標準（華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的總量＞6.0%）[1]。究其原因可能為因其市場價格較高每千克1萬多元，蟾酥在市場流通過程中，可能被人為摻假。

干蟾是治療腫瘤類疾病的地方藥材，有毒。研究表明，干蟾中的蟾蜍二烯羥酸內酯類化合物具有明顯的抗腫瘤活性。使用過程中多用于癌癥的治療及配合放、化療，不僅能夠有效抑制癌細胞的過度增殖，還具有減輕放、化療毒副作用，改善血象的功效[12-14]。由本實驗指標成分含量測定結果可知，吉林與山東干蟾藥材樣品中脂蟾毒配基與華蟾酥毒基含量差別較大，其中山東干蟾（大）樣品，華蟾酥毒基含量最高為0.041 1 mg·g－1，山東干蟾（?。悠罚付九浠孔罡邽?.017 3 mg·g－1。樣品3與樣品4，樣品9與樣品10含量測定結果對比表明，干蟾（?。悠分?種指標成分——蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量要明顯高于干蟾（大）樣品。

蟾衣作為一種民間藥材研究較少，但其抗肝癌和消腹水作用在民間廣為傳用，且毒性很低。又因為蟾衣是蟾蜍自然脫下的角質外衣，可人工活體取衣循環(huán)利用，對蟾蜍不造成任何傷害，是一種很好的可持續(xù)利用中藥新資源。本實驗測得蟾衣中華蟾酥毒基平均含量為0.027 0 mg·g－1，脂蟾毒配基平均含量為0.031 3 mg·g－1；樣品5與樣品 6，樣品11與樣品12含量測定結果表明，蟾衣樣品中4種指標成分含量因蟾蜍生長年限不同，其藥材質量會產生差異；脂蟾毒配基含量：蟾衣（大）＜蟾衣（小），蟾毒靈：含量蟾衣（小）＜蟾衣（大）。因此，蟾衣作為微毒類藥材，其用量可根據蟾蜍生長年限（或同基原蟾蜍蟾衣大?。┑牟煌M行合理調整。