川芎嗪對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞損傷及凋亡的影響及其機(jī)制研究

岑晴云，蔡清香，劉慧慧，吳財(cái)能

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是心臟缺血性疾病和心臟外科手術(shù)圍術(shù)期常見的病理生理現(xiàn)象，由心肌細(xì)胞在冠脈灌注血流中斷后再恢復(fù)灌注引起，導(dǎo)致心肌出現(xiàn)能量代謝障礙甚至血管無復(fù)流改變，臨床上表現(xiàn)為心肌頓抑、心肌收縮及舒張功能下降及反復(fù)發(fā)作的心律失常事件[1]。因此，如何減少心肌缺血再灌注損傷已成為心臟血運(yùn)重建治療領(lǐng)域的新挑戰(zhàn)。本研究擬通過體外培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞，構(gòu)建H9C2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型，觀察川芎嗪(Tetramethylpyrazine，TMP)對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞損傷及細(xì)胞凋亡的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的影響，為TMP在心肌保護(hù)方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞標(biāo)本 H9C2心肌細(xì)胞株(北京中科院細(xì)胞中心)。

1.2 試劑及儀器 胎牛血清(杭州四季青公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(美國(guó)Amresco公司)；Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法測(cè)細(xì)胞凋亡率試劑盒(奧地利Bender公司)；紫外分光光度計(jì)(日本shmadzu UV-2401PC)；酶標(biāo)儀(澳大利亞Biocell公司)；IP400三氣培養(yǎng)箱(日本雅馬拓公司)。

1.3 細(xì)胞制備 細(xì)胞復(fù)蘇：取出存放于液氮凍存管中的H9C2細(xì)胞放入37℃水浴箱中解凍，無菌條件下吸出細(xì)胞懸液，置于離心管中，加入10 mL培養(yǎng)基后吹打懸浮細(xì)胞。細(xì)胞提取及孵育：將離心管置于離心機(jī)以700 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基吹打，適當(dāng)稀釋后，以105/mL的密度移入培養(yǎng)瓶并置于培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中孵育，2～3天傳代1次。

1.4 模型制備 對(duì)照組(NC組)：按正常流程孵育H9C2心肌細(xì)胞；缺氧復(fù)氧損傷組(HR組)：將無血清DMEM/F12培養(yǎng)液移入待用的H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，調(diào)整三氣培養(yǎng)箱參數(shù)為缺氧狀態(tài)(37℃，95%N2，5%CO2，O2≤2%)，再將培養(yǎng)瓶置于三氣培養(yǎng)箱中孵育3 h，取出后放于恒溫培養(yǎng)箱中再孵育3 h。TMP預(yù)處理L組(TMP-L組)，M組(TMP-M組)和H組(TMP-H組)：將無血清DMEM/F12培養(yǎng)液移入待用的H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)瓶，再加入不同濃度TMP預(yù)處理后，缺氧及復(fù)氧的孵育流程同HR組。TMP-L組、TMP-M組、TMP-H組的濃度分別為60μg/mL、200μg/mL、800μg/mL[2]。

1.5 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞存活率 用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值(OD值)。與實(shí)驗(yàn)孔平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基的空白對(duì)照孔。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組光OD值/對(duì)照組OD值×100%[3]。

1.6 測(cè)定乳酸脫氫酶（LDH）活力 在缺氧前、缺氧末期及復(fù)氧末期，取不同處理組的細(xì)胞培養(yǎng)基，按檢測(cè)試劑盒說明書操作。LDH活力(U/L)=(測(cè)定管A值－測(cè)定空白管A值)/(標(biāo)準(zhǔn)管A值－標(biāo)準(zhǔn)空白管A值)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(2μmol/mL)×1 000 mL×稀釋倍數(shù)[4]。

1.7 測(cè)定SOD活性和MDA含量 收集H9C2細(xì)胞，經(jīng)超聲破碎處理后分別按照試劑盒說明測(cè)定SOD活性和MDA含量[5]。

1.8 檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡 用Annexin V/FITC，PI雙染流式細(xì)胞儀，按照試劑盒說明檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。

1.9 測(cè)定心肌細(xì)胞bcl-2 mRNA與bax mRNA表達(dá)水平 心肌細(xì)胞總RNA提取后，采用紫外光檢測(cè)樣品純度和定量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以(±s)表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩變量比較采用Pearson積差相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞OD、LDH、SOD及MDA變化比較 見表1。與NC組比較，HR組細(xì)胞活力顯著減弱，LDH釋放量顯著增加，SOD活性降低，MDA含量增多。與HR組比較，TMP-M組和TMP-H組細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)，LDH釋放量顯著減少；SOD活性增強(qiáng)，MDA含量下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與TMP-L組比較，TMP-M組與TMP-H組LDH釋放量，MDA含量均下降(P＜0.05)，TMP-H組SOD活性升高(P＜0.05)。與TMP-M組比較，TMP-H組OD值升高，MDA含量下降(P＜0.05)。

表1 各組細(xì)胞OD、LDH、SOD及MDA變化比較(±s)

表1 各組細(xì)胞OD、LDH、SOD及MDA變化比較(±s)

與NC組比較，①P＜0.05；與HR組比較，②P＜0.05；與TMP-L組比較，③P＜0.05；與TMP-M組比較，④P＜0.05

組別N C組H R組T M P-L組T M P-M組T M P-H組O D值0.3 3±0.0 1 0.2 0±0.0 1①0.2 1±0.0 2 0.2 4±0.0 1②0.2 6±0.0 1④L D H(U/L)1 0.5±3.1 9 8.1±4.9①7 3.9±2.6 5 9.4±1.3②③4 2.5±3.7②③S O D(U/m g)1 7 8.8±7.4 1 1 7.5±6.1①1 2 3.6±1 2.8 1 3 7.0±7.4②1 4 6.0±1 2.8②③M D A(n m o l/m g)0.9±0.2 4.4±0.1①3.9±0.2 2.8±0.3②③2.0±0.3②③④

2.2 各組細(xì)胞凋亡率、bcl-2 mRNA、bax mRNA表達(dá)水平比較 見表2。與NC組比較，HR組出現(xiàn)大量心肌細(xì)胞凋亡，bcl-2 mRNA表達(dá)顯著下降，bax mRNA表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與 HR組比較，TMP-L組、TMP-M組和TMP-H組心肌細(xì)胞凋亡率及bcl-2 mRNA表達(dá)顯著下降，bax mRNA表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與TMP-L組比較，TMP-M組bcl-2 mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05)；TMP-H組細(xì)胞凋亡率及bax mRNA表達(dá)下降，bcl-2 mRNA表達(dá)上升(P＜0.05)。與TMP-M組比較，TMP-H組細(xì)胞凋亡率及bax mRNA表達(dá)下降，bcl-2 mRNA表達(dá)上升(P＜0.05)。

表2 各組細(xì)胞凋亡率、bcl-2 mRNA、bax mRNA表達(dá)水平比較(±s)

表2 各組細(xì)胞凋亡率、bcl-2 mRNA、bax mRNA表達(dá)水平比較(±s)

與NC組比較，①P＜0.05；與HR組比較，②P＜0.05；與TMP-L組比較，③P＜0.05；與TMP-M組比較，④P＜0.05

組別N C組H R組T M P-L組T M P-M組T M P-H組細(xì)胞凋亡率(%)1.5 0±3.1 0 4 0.9 0±7.2 0①3 0.8 0±7.4 0②2 7.3 0±6.9 0②1 9.0 0±7.6 0②③④b c l-2 m R N A 2.5 0±0.3 3 0.9 4±0.2 5①0.9 2±0.4 8 1.3 7±0.3 0②③1.9 0±0.4 6②③④b a x m R N A 0.8 8±0.1 3 2.3 0±0.2 5①2.0 4±0.3 5 1.8 0±0.2 4②1.5 0±0.3 6②③④

3 討論

隨著冠脈支架植入術(shù)、冠狀動(dòng)脈溶栓術(shù)、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)等心臟介入手術(shù)的廣泛開展，冠心病患者的生存率較以前顯著提高，但伴隨的再灌注損傷仍嚴(yán)重影響后期心肌功能的恢復(fù)，因此解決心肌缺氧后復(fù)氧產(chǎn)生的再灌注損傷對(duì)臨床具有重要的意義。目前的體外研究發(fā)現(xiàn)，氧自由基(OFR)的大量釋放、細(xì)胞凋亡、鈣超載是MIRI過程極為重要的病理生理改變[6～7]。此外，心肌酶如LDH的大量釋放則反映了心肌的損傷程度，已被作為常用的檢測(cè)指標(biāo)。

OFR在心肌細(xì)胞缺血狀態(tài)下被大量釋放，誘發(fā)失控的氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而損傷細(xì)胞膜；更為重要的是OFR具有強(qiáng)烈的引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化作用，生成終產(chǎn)物MDA，進(jìn)一步加劇膜的損傷，使得LDH透過細(xì)胞膜被大量釋放入血，心肌細(xì)胞活力下降[8]。機(jī)體基于氧化-抗氧化的平衡機(jī)制，SOD作為體內(nèi)重要的抗氧化物酶亦釋放增多，用以清除體內(nèi)過度釋放的自由基，減少細(xì)胞膜的損傷。因此MDA常被用于間接反映機(jī)體的氧化損傷，而SOD反映抗氧化能力。本研究發(fā)現(xiàn)H9C2細(xì)胞缺氧復(fù)氧后細(xì)胞活力顯著減弱，LDH釋放量顯著增加，提示心肌細(xì)胞大量損傷；同時(shí)MDA含量明顯增加，SOD活性顯著降低，說明心肌細(xì)胞損傷與其膜脂過氧化有關(guān)。

機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)下大量產(chǎn)生的OFR除損傷細(xì)胞膜，還是細(xì)胞凋亡重要的啟動(dòng)因子，同時(shí)鈣超載亦促進(jìn)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡增多則進(jìn)一步加重MIRI。研究發(fā)現(xiàn)，再灌注期通過抑制心肌凋亡可顯著減少心肌梗塞面積、改善心肌收縮功能[9]。心肌細(xì)胞凋亡受多基因調(diào)控，其中bax、bcl-2基因被認(rèn)為是最重要的2個(gè)基因。bax與bcl-2基因結(jié)構(gòu)相似，但作用相反。Bax基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而bcl-2表達(dá)產(chǎn)物可阻斷bax、fas等基因產(chǎn)物激活細(xì)胞凋亡信號(hào)傳遞系統(tǒng)的最后通路，從而促進(jìn)細(xì)胞成活[10～11]。本研究發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，HR組出現(xiàn)大量心肌細(xì)胞凋亡，TMP組心肌細(xì)胞凋亡率則較HR組顯著下降。與NC組比較，HR組和TMP組的bcl-2表達(dá)均顯著下降，bax表達(dá)均顯著升高。而隨著川芎嗪預(yù)處理濃度的提升，bcl-2的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，bax的表達(dá)則呈下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

TMP是中藥川芎的有效成分，具有保護(hù)血管內(nèi)皮、活血化瘀、抗血小板聚集等作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TMP對(duì)MIRI具有保護(hù)作用，其主要機(jī)制有：①促進(jìn)一氧化氮(NO)合成，抑制內(nèi)皮素(ET)水平，保護(hù)血管內(nèi)皮并逆轉(zhuǎn)其功能紊亂[12～13]；②清除OFR，減少脂質(zhì)過氧化，減輕心肌能量代謝障礙[12～14]；③減輕缺血組織細(xì)胞的鈣超載[12～13]；④降低細(xì)胞缺血再灌注損傷后腫瘤壞死因子的表達(dá)水平[13～14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與HR組比較，TMP-L組、TMP-M組、TMP-H組LDH、MDA含量均明顯降低，細(xì)胞活力和SOD活性明顯升高，其中TMP-H組差異最為顯著。bcl-2表達(dá)升高的同時(shí)bax的表達(dá)下降，心肌細(xì)胞凋亡率下降，提示TMP在缺血再灌注損傷的心肌細(xì)胞中能提高細(xì)胞抗氧化能力，降低細(xì)胞損傷程度。

本研究利用H9C2心肌細(xì)胞建立缺氧復(fù)氧損傷模型和TMP預(yù)處理模型，并通過細(xì)胞活力等一系列指標(biāo)評(píng)估心肌細(xì)胞的損傷程度，結(jié)果表明一定濃度范圍內(nèi)的TMP預(yù)處理可減輕心肌細(xì)胞的缺氧復(fù)氧損傷，且隨TMP預(yù)處理濃度的增加心肌損傷呈減少趨勢(shì)；其作用可能與提高心肌細(xì)胞活力、增強(qiáng)SOD活性、降低LDH釋放量、減少M(fèi)DA生成、抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)，其具體機(jī)制及進(jìn)一步的臨床心肌保護(hù)應(yīng)用尚需進(jìn)一步研究。