燈盞益腎顆粒對糖尿病腎病大鼠腎臟組織病理影響的研究

杜義斌，謝銘君，段艷蕊，易歡

1.云南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650021；2.云南中醫(yī)學院，云南 昆明 650500

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(Diabetes mellitus，DM)重要的微血管并發(fā)癥，可導致終末期腎臟疾病(End Stage Renal Disease，ESRD)，從而致殘、致死[1～2]。既往的臨床和實驗研究發(fā)現(xiàn)燈盞益腎顆?？筛纳瓢―M等多種原發(fā)病導致的人或大鼠的慢性腎功能衰竭，減輕慢性腎功能衰竭大鼠腎間質(zhì)炎性細胞浸潤，從而防治腎小球硬化及間質(zhì)纖維化[3～4]。但對DN尚未開展深入研究。本實驗通過觀察燈盞益腎顆粒對DN大鼠腎臟組織形態(tài)學的影響，探討燈盞益腎顆粒對DN腎臟病理的影響，為實驗藥物治療DN提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性成年SD大鼠，健康清潔，體質(zhì)量(230±20)g，8周齡，共90只。購養(yǎng)于昆明醫(yī)科大學動物實驗學部，許可證號：SCXK(滇)2016-0003。

1.2 實驗藥物、試劑及主要儀器 藥物：燈盞益腎顆粒，天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：1509341，由燈盞花、黃芪、薏苡仁、杜仲、山藥、淫羊藿、蒼術(shù)、千層紙、黨參及生大黃10味藥組成。洛汀新(鹽酸貝那普利片)，北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：X2209。

試劑：鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)，美國Sigma公司；PAS染色試劑盒，京索萊寶科技有限公司；HE染色試劑盒，天津致遠化學試劑有限公司；Masson染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；目測尿蛋白試紙，廣州市花都高爾寶生物技術(shù)有限公司。

主要儀器：血糖分析儀及試紙，三諾生物傳感技術(shù)有限股公司；羅氏全自動生化儀Modular P800，德國羅氏公司；VK-X系列激光掃描共聚焦顯微鏡，中國基恩士公司。

1.3 動物分組及模型建立 將大鼠隨機分正常組(A組)、模型組(B組)、鹽酸貝那普利組(C組)、燈盞益腎顆粒低劑量組(D組)、燈盞益腎顆粒中劑量組(E組)和燈盞益腎顆粒高劑量組(F組)，共6組，每組各15只。6組大鼠，禁食12 h，稱重后，將B、C、D、E、F 5組制備DN模型。將檸檬酸2.1 g加入100 mL雙蒸水中配成A液，將檸檬酸鈉2.94 g加入100 mL雙蒸水中配成B液，將A、B液按1∶1混合，pH值為4.2，再使用1%檸檬酸鹽緩沖液溶解STZ，按55 mg/kg的劑量一次性左側(cè)腹腔注射[5]。A組用等量生理鹽水腹腔注射。各組均給予標準飲食，更換墊料，定期消毒籠具。造模處理后72 h連續(xù)測3天空腹血糖，血糖值＞16.7 mmol/L為DM模型制備成功。造模后的大鼠喂養(yǎng)1周后測隨機血糖＞16.7 mmol/L，尿量為A組的1.5倍及以上，考馬斯亮藍法測定24 h尿蛋白(24-hour Urinary Protein，24-hrUP)為A組的1.5倍及以上，則為DN模型制備成功[5～8]。

1.4 實驗干預方法 造模成功后，進行藥物治療。A組、B組均予10 mL/kg生理鹽水灌胃，每天1次；C組予1.05 mg/kg的鹽酸貝那普利片；D組、E組、F組予燈盞益腎顆粒，分別按1.89 g/kg、9.45 g/kg、18.9 g/kg給藥。C、D、E、F組分別用10 mL/kg生理鹽水溶解藥物后灌胃，每天1次。各組連續(xù)灌胃6周。

1.5 檢測方法、指標 造模前、造模后1周測定血糖和24-hrUP，灌胃6周結(jié)束前1天，禁食，正常飲水，收集尿液，記錄尿量，取4 mL，3 000 r/min，離心15 min，取上清液，-20℃低溫保存。實驗最后1天，用10%水合氯醛按照4 mL/kg劑量腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血，分離血清(3 000 r/min，離心15 min)-20℃低溫保存。用羅氏全自動生化儀Modular P800檢測24-hrUP、尿素氮(Blood Uria Nitrogen，BUN)、 胱 抑 素 C(CystatinC， CysC)、 肌 酐 (Serum Creatinine，SCr)。取腎臟，去除被膜，用生理鹽水灌洗腎臟血管，以除去血液，濾紙干燥，電子天平稱重，用10%甲醛液固定，病理制片，HE染色、PAS染色、Masson染色，用Nikon ECLIPSE 50i研究型系統(tǒng)生物顯微鏡觀察組織形態(tài)、細胞成分、染色特征以及有無病理變化，再按病變程度及范圍，進行評分。

隨機取互不重疊的10個視野，觀察腎小球/腎小管間質(zhì)的病變，進行半定量評分，共包括7項具體的項目。計量每個腎小球/腎小管間質(zhì)病變程度和范圍并計分，求其均值確定為腎小球和腎小管間質(zhì)病變分值。損傷程度分為0～3級，腎小球系膜基質(zhì)增生按病理損害的病變程度計分為，無增生：0分；相應(yīng)視野區(qū)域增生基質(zhì)未超過毛細血管腔直徑：1分；相應(yīng)視野區(qū)域增生基質(zhì)對毛細血管袢有一定的壓迫和破壞：2分；相應(yīng)視野區(qū)域增生基質(zhì)對腎小球毛細血管袢有嚴重的壓迫：3分。而腎小球基底膜增厚、腎皮質(zhì)壞死、腎小管管腔擴張、腎小管上皮細胞空泡樣變性、腎小管壞死、組織炎癥細胞浸潤等按病理損害的病變程度計分為：正常：0分；輕度損害(病變范圍＜30%)：1分；中度損害(病變范圍30%～60%)：2分；重度損害(病變范圍＞60%)：3分[9]。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(±s)表示，符合正態(tài)分布，造模前后比較采用配對樣本t檢驗，組間比較采用單因素方差分析(先使用Levene檢驗檢測方差齊性，方差齊時用SNK-q法，方差不齊時用Tamhane's T檢驗)；不符合正態(tài)分布，則進行秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況 A組大鼠雙目有神，反應(yīng)靈敏，活動自如，皮毛光滑、干凈，進食、飲水及大小便正常、無特殊氣味。實驗結(jié)束時體質(zhì)量增加。與A組比較，B組大鼠皮毛枯燥黃染，下腹部、外陰潮濕，精神差，活動少，易激怒，進食量減少，小便量明顯增多(尿量為A組的1.5倍以上)，體質(zhì)量減輕。與B組比較，D組、C組、E組和F組逐漸好轉(zhuǎn)，恢復最明顯為E組。實驗結(jié)束時所剩大鼠分別為：A組13只、B組10只、C組11只、D組11只、E組12只和F組12只。

2.2 各組大鼠造模前后空腹血糖和24-hrUP定量結(jié)果比較見表 1。與 A組比較，B、C、D、E、F組大鼠血糖和24-hrUP升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與本組造模前比較，B、C、D、E、F組大鼠造模后的血糖和24-hrUP升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠造模前后空腹血糖和24-hrUP定量結(jié)果比較(±s)

表1 各組大鼠造模前后空腹血糖和24-hrUP定量結(jié)果比較(±s)

與A組比較，①P＜0.05；與本組造模前比較，②P＜0.05

組別A組B組C組D組E組F組n 血糖(m m o l/L) 2 4-h r U P(m g)1 3 1 0 1 1 1 1 1 2 1 2造模前3.6 4±0.4 0 3.3 7±0.6 0 3.6 1±0.5 0 3.5 9±0.5 0 3.5 3±0.5 6 3.6 3±0.6 9造模后3.8 2±0.2 9 1 7.8 7±2.6 2①②1 9.7 4±5.3 4①②1 8.8 2±2.8 4①②1 8.0 5±0.8 9①②1 7.9 0±0.6 2①②造模前1 3.8 5±0.5 0 1 4.2 2±0.8 8 1 4.0 3±0.8 0 1 3.7 7±0.5 8 1 3.9 4±0.7 8 1 4.0 5±0.6 2造模后1 4.0 7±1.0 9 3 9.0 0±5.3 8①②3 8.4 1±4.5 5①②3 8.7 7±4.8 5①②3 8.8 9±3.9 9①②3 9.4 0±3.8 1①②

2.3 各組大鼠尿微量白蛋白/尿肌肝（ACR） 檢測結(jié)果比較見表2。與A組比較，B組ACR明顯升高(P＜0.01)；與B組比較，C、D、E、F組ACR明顯降低(P＜0.05)；與C、D組比較，E、F組ACR降低(P＜0.05)。

表2 各組大鼠ACR檢測結(jié)果比較(±s) mg/g

表2 各組大鼠ACR檢測結(jié)果比較(±s) mg/g

與A組比較，①P＜0.01；與B組比較，②P＜0.05；與C、D組比較，③P＜0.05

組別A組B組C組D組E組F組n 1 3 1 0 1 1 1 1 1 2 1 2 A C R 2 1.5 8±3.9 7 4 6.9 3±6.1 6①4 1.0 1±6.2 9①3 9.9 9±8.2 8①3 4.5 6±5.9 1②③3 4.4 3±5.4 3②③

2.4 各組大鼠腎功能比較 見表3。與A組比較，B組BUN、CysC明顯升高(P＜0.01)；與B組比較，C、D、F組BUN降低(P＜0.05)，E組BUN降低(P＜0.01)，C、D組CysC降低(P＜0.05)，E、F組CysC降低(P＜0.01)；與C、D組比較，E、F組CysC降低(P＜0.05)。各組間SCr兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表3 各組大鼠腎功能比較(±s)

表3 各組大鼠腎功能比較(±s)

與A組比較，①P＜0.01；與B組比較，②P＜0.05，③P＜0.01；與C、D組比較，④P＜0.05

組別A組B組C組D組E組F組n 1 3 1 0 1 1 1 1 1 2 1 2 B U N(m m o l/L)5.5 3±0.7 2 1 0.5 2±0.2 8①1 0.0 1±0.3 9②9.9 5±0.5 5②9.5 1±0.6 1③9.9 7±0.5 4②C y s C(m g/L)0.9 6±0.1 5 4.7 2±0.4 7①1.5 6±0.3 6②1.5 4±0.2 8②1.2 5±0.2 8③④1.2 2±0.2 7③④S C r(u m o l/L)4 6.0 0±1 1.8 5 4 7.9 0±8.0 3 4 8.0 0±8.9 4 4 4.9 1±6.8 5 5 1.8 3±5.7 2 5 0.0 8±8.3 9

2.5 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學改變比較 見圖1、圖2、圖3、圖4。A組腎臟基本正常，腎小球囊清晰可見，未見明顯的系膜增生或毛細血管變性。管上皮細胞呈立方狀，長柱狀紅染，腎小管管腔不明顯。皮質(zhì)、髓質(zhì)無炎癥。B組腎臟可見明顯病變，表現(xiàn)為中重度腎小球增大，系膜基質(zhì)增生明顯，局部可見球囊融合，多個腎小管管腔明顯，上皮細胞空泡化，有的腎小管上皮細胞脫落。此外，B組還出現(xiàn)腎臟皮質(zhì)片狀嚴重炎癥，腎小管片狀壞死，大量的炎癥細胞局部浸潤，并侵及腎小球。腎乳頭部小灶狀炎癥，個別腎小管壞死。與A組相比腎臟病變明顯，且全部有病變，說明造模成功。C組腎臟可見明顯病變，表現(xiàn)為輕重不一的腎小球腎小管病變，重者腎小球增大，系膜基質(zhì)增生明顯，可見球囊融合，多個腎小管管腔明顯，上皮細胞空泡化，有的腎小管上皮細胞脫落。輕者腎小球增大，系膜基質(zhì)輕度增生，少數(shù)腎小管上皮細胞空泡化。此外，部分腎臟皮質(zhì)片狀中重炎癥，部分輕度炎癥。腎小球、腎小管的病變的輕于B組，體現(xiàn)了陽性藥物的治療作用。D、E、F組腎臟均可見與B組相似的病變，腎小球、腎小管的病變輕于B組，體現(xiàn)了燈盞花3個劑量組的治療作用，腎小球系膜基質(zhì)聚集、GBM增生、腎小管管腔擴張和腎小管上皮細胞空泡樣變性等方面體現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。

圖1 HE染色（×200）

圖2 HE染色（×400）

圖3 PAS染色 (×100)

圖4 Masson染色 (×100)

各組大鼠腎臟組織形態(tài)學改變評分，見表4。與A組比較，B組腎小球系膜基質(zhì)增生、腎小球基底膜(GBM)增厚、腎小管管腔擴張、腎小管上皮細胞空泡樣變性明顯、腎皮質(zhì)壞死、腎小管壞死、腎組織炎性細胞浸潤明顯(P＜0.01)。與B組比較，C、D、E、F組腎小球系膜基質(zhì)增生、腎小球基底膜(GBM)增厚、腎小管管腔擴張、腎小管上皮細胞空泡樣變性改善(P＜0.05)；D、E、F組腎皮質(zhì)壞死、腎小管壞死、腎組織炎性細胞浸潤改善(P＜0.05)。與C、D組比較，E、F組腎小球系膜基質(zhì)增生、腎小球基底膜(GBM)增厚、腎小管管腔擴張、腎小管上皮細胞空泡樣變性改善(P＜0.05)。與C組比較，D、E、F組腎皮質(zhì)壞死、腎小管壞死、腎組織炎性細胞浸潤改善(P＜0.05)。

表4 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學改變評分比較(±s) 分

表4 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學改變評分比較(±s) 分

與A組比較，①P＜0.01；與B組比較，②P＜0.05；與C組比較，③P＜0.05；與D組比較，④P＜0.05

組別A組B組C組D組E組F組n 1 3 1 0 1 1 1 1 1 2 1 2腎小球系膜基質(zhì)增生0 2.1 0±0.8 8①1.0 0±0.7 8②1.0 9±0.7 0②0.4 2±0.5 2②③④0.3 3±0.4 9②③④腎小球G B M增厚0 2.2 0±0.7 9①1.2 7±0.6 5②1.1 8±0.8 7②0.5 0±0.6 7②③④0.5 8±0.7 9②③④腎小管管腔擴張0 2.4 0±0.7 0①1.7 3±0.7 9②1.6 4±0.6 7②0.6 7±0.8 9②③④0.7 5±0.9 7②③④腎小管上皮細胞空泡樣變性0 2.5 0±0.5 3①1.9 1±0.5 4②1.8 2±0.6 0②1.2 5±0.6 2②③④1.1 7±0.7 2②③④腎皮質(zhì)壞死0 2.7 0±0.4 8①2.5 5±0.6 9 1.6 4±1.1 2②③1.7 5±1.0 6②③2.0 0±0.6 0②③腎小管壞死0 2.6 0±0.5 2①2.4 5±0.6 9 2.0 0±0.6 3②③1.9 2±0.6 7②③1.6 7±0.8 9②③腎組織炎性細胞浸潤0 2.7 0±0.4 8①2.6 4±0.5 1 1.5 5±0.8 2②③1.5 8±0.7 9②③1.8 3±0.9 4②③

3 討論

中醫(yī)學將DN歸于消渴、腎消、腎渴、水腫、關(guān)格等范疇。認為稟賦不足、飲食不節(jié)、勞欲太過、情志失調(diào)，導致腎臟虧虛，氣化失司，發(fā)為本病?；静C為本虛標實，虛實夾雜，虛為脾腎虛損。標實為瘀血、痰濕、濁毒。中醫(yī)學認為脾為人體后天之本及氣血生化之源。脾具有散精、升清以及固攝的功能。血糖為水谷精微，當脾氣虛，運化失司，表現(xiàn)為胰島素絕對或相對不足，則水谷精微積聚而生濕化濁，表現(xiàn)為血糖升高，發(fā)為DM。脾氣虛則固攝無力，失于攝納則精微流失，小便可出現(xiàn)尿蛋白。消渴病若失治誤治，病情逐漸發(fā)展可影響到腎臟，導致脾腎兩虛。脾虛攝納無力，腎虛封藏無權(quán)，人體精微流失加重，表現(xiàn)為蛋白尿持續(xù)增加。DM的病情進展至DN階段，已是“五臟窮極，必歸于腎”，本虛是必然的。所以，DN大都以脾傷及脾虛為起始，后期波及腎臟[10]。筆者根據(jù)本病的發(fā)病機理，認為本病應(yīng)補虛泄實，扶正祛邪。具體治法扶正以健脾補腎為主，祛邪以泄?jié)峄钛獮橹?。燈盞益腎顆粒是云南省中醫(yī)醫(yī)院的院內(nèi)科研制劑，有健脾補腎，泄?jié)峄钛墓π?。本方以黃芪、燈盞花為君藥，健脾益氣、祛濕活血；山藥、生大黃、淫羊藿為臣藥，益氣健脾、固精補腎、泄?jié)峄钛稽h參、薏苡仁、蒼術(shù)、杜仲、千層子益氣補腎、燥濕泄?jié)釣樽羰顾帯Ｈ椒稣粦傩?，攻邪不傷正?/p>

DN是DM常見而難治的微血管并發(fā)癥。2015年中華醫(yī)學會內(nèi)分泌學分會組織內(nèi)分泌與腎臟病學相關(guān)專家參照美國糖尿病學會(ADA)和美國國家腎臟基金會(NKF)制定了中國成人DN臨床診斷的專家共識，共識指出DN典型的腎臟形態(tài)學改變包括：腎小球基底膜增生變厚、腎小球系膜基質(zhì)增寬、腎小球局灶或全球硬化、基底膜足細胞丟失、腎小管萎縮及細胞凋亡增加、腎間質(zhì)炎性浸潤、腎間質(zhì)纖維化、管周毛細血管稀疏、出入球小動脈壁玻璃樣變[11～12]。DM引起腎小球形態(tài)學改變是DN的主要病理改變，早期表現(xiàn)為基底膜增厚和系膜基質(zhì)增寬，晚期則演變?yōu)槟I小球全球硬化。研究發(fā)現(xiàn)，慢性持續(xù)血糖增高除可以累及全腎，除腎小球各結(jié)構(gòu)損害外，還包括腎間質(zhì)(腎小管間質(zhì)、腎臟血管)病變[13]。腎小管病變可在腎小球病變之前，之后或同時發(fā)生，早期表現(xiàn)為腎小管基底膜的增厚，晚期發(fā)生腎小管萎縮和間質(zhì)的纖維化。

對DN早期腎功能損傷的檢測受到廣泛關(guān)注，CysC是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，存在于各種組織的有核細胞和體液中，是一種低分子量，堿性非糖化蛋白質(zhì)，能被腎小球濾過而不被重吸收，可以反映腎小球濾過率的高低，發(fā)現(xiàn)腎臟功能早期波動[14]。臨床上SCr和BUN被廣泛用于檢測腎功能，但在腎小球濾過率尚未出現(xiàn)明顯下降時兩者并不會發(fā)生異常，只是隨著病情進展到一定程度，SCr和BUN才會升高[15]。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Renin Angiotensin Aldosterone System，RAAS)活性增強是DN重要的發(fā)病機制，可引起一系列病理改變，故抑制RAAS可延緩腎臟形態(tài)學改變，從而保護腎臟。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑/血管緊張素受體拮抗劑(ACEI/ARB)類藥物是RAAS抑制劑。循證醫(yī)學研究已證明，應(yīng)用ACEI/ARB類藥物可以延緩DN的進展[12，16]。實驗研究也發(fā)現(xiàn)，ACEI類藥物和AT1拮抗劑可能是通過對血管緊張素Ⅱ而抑制腎內(nèi)內(nèi)皮素(ET)的生成，進而降低腎內(nèi)轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1的表達，起到抑制腎臟肥大及ECM過度生成的作用，從而延緩DN的發(fā)生發(fā)展[12，16～20]。ACEI類藥物可通過減低腎小球內(nèi)“三高”現(xiàn)象、減少細胞外基質(zhì)形成、抑制基底膜增厚和細胞外基質(zhì)的積聚，從而延緩腎小球纖維化。本試驗結(jié)果也證實鹽酸貝那普利可以抑制腎小球系膜基質(zhì)增生，減輕GBM增厚，減輕腎小管管腔的擴張和腎小管上皮細胞的空泡樣變性。

本實驗結(jié)果提示，不同劑量燈盞益腎顆粒均可減輕DM對腎臟組織的病理損傷，主要表現(xiàn)為減緩腎小球系膜基質(zhì)增生和GBM增厚，減輕腎小管管腔擴張和腎小管上皮細胞空泡樣變性。隨著藥物劑量的增加上述治療效應(yīng)有增強的趨勢；實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)燈盞益腎顆粒有減輕腎皮質(zhì)壞死、腎小管壞死、腎組織炎性細胞浸潤的作用，但這些治療作用與藥物劑量無相關(guān)性。燈盞益腎顆粒的上述治療作用通過抑制糖尿病腎病的腎小球和腎小管病理損傷延緩了糖尿病腎病的自然進程，對腎功能和腎臟蛋白排泄量產(chǎn)生有益的影響，這種影響和已知的RAAS抑制劑鹽酸貝那普利對糖尿病腎病的保護作用的研究結(jié)果有相似的效應(yīng)。

綜上，燈盞益腎顆?？筛纳艱N大鼠的基本狀況，減輕腎功能損傷、減輕腎臟組織形態(tài)學病變。主要表現(xiàn)在抑制BUN和CysC升高，減輕腎小球系膜基質(zhì)增生、GBM增厚、腎小管管腔擴張和腎小管上皮細胞空泡樣變性的同時，減輕腎皮質(zhì)壞死、腎小管壞死、腎組織炎性細胞浸潤。鹽酸貝那普利也有類似的效應(yīng)。燈盞益腎顆粒是通過抑制RAAS發(fā)揮治療作用還是其它機制，有待進一步研究。