正交試驗(yàn)優(yōu)選女士保健酒滲漉工藝

李 妍,梁慧珍,張長(zhǎng)霞,蘇 靜,陳 鵬,賈士儒*

(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津 300457;2.天士力控股集團(tuán)研究院健保食品開發(fā)中心,天津 300000)

保健酒已有數(shù)千年的歷史,是中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)的重要組成部分[1]。女士保健酒的主要藥材有當(dāng)歸、人參、黃精、玉竹、枸杞子、大棗,該配方具有調(diào)經(jīng)止痛、補(bǔ)血活血、益氣安神的功效。其中人參為君藥,補(bǔ)氣安神[2];當(dāng)歸、黃精、玉竹為臣藥,補(bǔ)腎益精[3-7];配伍枸杞子能滋補(bǔ)肝腎之陰[8];大棗在增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗氧化、改善心血管系統(tǒng)、造血等方面有著明顯藥理作用[9],王留等[10]研究了在日糧中添加1 500 mg/kg的大棗多糖能夠提高斷奶仔豬血液中超氧化物歧化酶的含量和總抗氧化能力,降低丙二醛含量。六味藥合用有抑制黑色素生長(zhǎng)、抗氧化等功效。當(dāng)歸中含有多種有機(jī)酸類化合物,其代表為阿魏酸[11]。阿魏酸效應(yīng)物在較低濃度下能顯著降低酪氨酸酶的單酚酶活力,是一種強(qiáng)效的酪氨酸酶抑制劑[12]。5 mol/L的阿魏酸可有效抑制蝦血淋巴褐變,阿魏酸將蝦血淋巴中酪氨酸酶酶活抑制至5.97%[13]。人參提取液具有很強(qiáng)的抑菌消炎作用,是高檔化妝品的天然添加物,對(duì)婦女雀斑、褐斑、蝴蝶斑及老年皮膚色素沉著療效顯著[14]。劉戀等[15-17]研究了枸杞子水提物對(duì)酪氨酸酶活性的影響,枸杞子多糖對(duì)酪氨酸酶活性抑制能力很強(qiáng),枸杞子水提物對(duì)酪氨酸酶具有明顯抑制作用,其半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)為0.73 mg/mL。沈放等[18]研究了當(dāng)歸多糖對(duì)酪氨酸酶活性的影響,結(jié)果表明當(dāng)歸多糖對(duì)酪氨酸酶活性有較高的抑制作用,用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇提取當(dāng)歸后的濃縮浸膏進(jìn)行酪氨酸酶-多巴氧化實(shí)驗(yàn),當(dāng)歸浸膏(1 g/L)的酪氨酸酶抑制率為35.8%[19],具有良好的美白功效。酪氨酸酶在黑色素細(xì)胞代謝過(guò)程中起著催化作用,引起黑色素分泌增多,因此抑制該酶的活性就能減少色素的生成[20]?，F(xiàn)有的活性成分提取方法包括浸提和滲漉,浸提現(xiàn)在最為常用,簡(jiǎn)單方便,對(duì)設(shè)備要求比較低,能耗低,目前廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn),但得率不高,耗時(shí)長(zhǎng),限制保健酒的生產(chǎn)效率;與之相比較,滲漉屬于動(dòng)態(tài)浸出方法,具有溶劑利用率高,有效成分浸出完全,可直接收集浸出液等優(yōu)勢(shì)[21-22]。

本研究采用正交試驗(yàn),以阿魏酸、人參皂苷Rg1、Re及粗多糖含量為代表性指標(biāo)并進(jìn)行多指標(biāo)綜合評(píng)分,對(duì)女士保健酒中當(dāng)歸、人參、枸杞子、黃精、玉竹、大棗藥材的滲漉工藝進(jìn)行優(yōu)化,為最佳滲漉工藝參數(shù)的確立提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 藥材

實(shí)驗(yàn)所用藥材見(jiàn)表1。經(jīng)檢驗(yàn),所用藥材均符合《中國(guó)藥典》(2015年版一部)的規(guī)定。

表1 實(shí)驗(yàn)所用藥材Table1 Medicinal materials used in the experiment

1.1.2 化學(xué)試劑

食用酒精(純度95.2%):吉林省新天龍實(shí)業(yè)股份有限公司;磷酸(色譜純):上海晶都生物技術(shù)有限公司;乙腈(色譜純):美國(guó)OMNI公司;鹽酸(分析純):天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;酒石酸鉀鈉(分析純)、亞鐵氰化鉀(分析純):天津威晨化學(xué)試劑科貿(mào)有限公司;硫酸銅(分析純)、無(wú)水葡萄糖(純度98.0%)、氫氧化鈉(分析純)、亞甲基藍(lán)(指不劑):天津市化學(xué)試劑一廠;人參皂苷Rg1(純度91.7%)、人參皂苷Re(純度98.0%)、阿魏酸(純度99.0%):中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲醇(色譜純):德國(guó)默克股份兩合有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Venusil MPC C18(2)色譜柱:天津博納艾杰爾科技有限公司;KQ-250E型超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;安捷倫1260高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀:美國(guó)安捷倫公司;Milli-Q超純水處理系統(tǒng):北京艾澤信科技有限公司密理博北京代理;歐美國(guó)家進(jìn)口膜(尼龍膜):天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;XS105型十萬(wàn)分之一天平:梅特勒-托利多儀器上海有限公司;DL-I-15臺(tái)式封閉電爐:天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 滲漉工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

影響滲漉工藝的主要因素有滲漉溫度、滲漉流速、滲漉前浸泡時(shí)間。在正交試驗(yàn)前,首先進(jìn)行滲漉溫度(4℃、20℃、25℃、30℃、35℃)、滲漉流速(0.2mL/min、0.4mL/min、0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min)、滲漉前浸泡時(shí)間(8 h、12 h、24 h、36 h、48 h)單因素試驗(yàn),對(duì)滲漉工藝的因素與水平進(jìn)行初步篩選。

1.3.2 滲漉工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以滲漉溫度(A)、滲漉流速(B)、滲漉前浸泡時(shí)間(C)為影響因素,阿魏酸、人參皂苷Rg1、Re和粗多糖含量為考察指標(biāo),優(yōu)化滲漉工藝,正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2。

表2 滲漉工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table2 Factors and levels of orthogonal tests for percolation process optimization

1.3.3 考察指標(biāo)的確定及評(píng)價(jià)方法

女士保健酒中的當(dāng)歸、人參、枸杞子、大棗、玉竹和黃精具有較多生物活性成分,其中代表性成分有阿魏酸,人參皂苷Rg1、Re和粗多糖。故在滲漉工藝中以阿魏酸含量、人參皂苷Rg1、Re含量和粗多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分,以考察提取是否完全。

本課題研究采用多指標(biāo)試驗(yàn)簡(jiǎn)易綜合評(píng)分法,可化多指標(biāo)為單指標(biāo)。阿魏酸、人參皂苷Rg1、Re和粗多糖的含量除以各自的標(biāo)準(zhǔn)差,乘以各自的權(quán)重系數(shù)。

確定權(quán)重系數(shù):考慮到女士保健酒六味藥的君臣佐使關(guān)系及所含功效成分的特點(diǎn),選擇阿魏酸、人參皂苷Rg1、Re和粗多糖作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。根據(jù)主成分權(quán)重系數(shù)大原則,阿魏酸含量(ai)(權(quán)重系數(shù)為0.30)、人參皂苷Rg1含量(bi)(權(quán)重系數(shù)為0.15)、人參皂苷Re含量(ci)(權(quán)重系數(shù)為0.15)和粗多糖含量(di)(權(quán)重系數(shù)為0.40),進(jìn)行綜合評(píng)分(xi)[23],其計(jì)算公式如下:

式中:xi為綜合評(píng)分,分;ai為阿魏酸含量,mg/L;bi為人參皂苷Rg1含量,mg/L;ci為人參皂苷Re含量,mg/L;di為粗多糖含量,mg/L;s1,s2,s3,s4依次為阿魏酸、人參皂苷Rg1、Re和粗多糖測(cè)定含量的標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3.4 阿魏酸含量的測(cè)定[24]

采用高效液相色譜法測(cè)定阿魏酸含量。

色譜條件:Venusil MPC18(2)色譜柱(4.60mm×250mm,5μm),流動(dòng)相:乙腈-0.085%磷酸溶液(17∶83,V/V);檢測(cè)波長(zhǎng)為316 nm;柱溫35℃,流速0.80 mL/min,進(jìn)樣量:10μL。

對(duì)照品溶液的制備:精密稱取阿魏酸對(duì)照品適量,置于棕色量瓶中,加體積分?jǐn)?shù)為70%甲醇制成0.036 mg/mL的阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。供試品溶液的制備:取酒液樣品過(guò)0.45μm膜濾。

測(cè)定方法:精密吸取已配制質(zhì)量濃度為0.036mg/mL的對(duì)照品溶液0.10 mL、0.70 mL、1.40 mL、2.10 mL、2.80 mL、3.50 mL,分別于5 mL容量瓶中,加體積分?jǐn)?shù)為70%甲醇稀釋至刻度,搖勻,分別進(jìn)樣10μL,記錄色譜圖和峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo),阿魏酸質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程為Y=63 989X-0.767 6,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。另精密吸取供試品溶液10μL注入HPLC色譜儀,記錄峰面積;分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL,注入液相色譜儀測(cè)定,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中阿魏酸含量。

1.3.5 人參皂苷Rg1和人參皂苷Re含量的測(cè)定

采用高效液相色譜法測(cè)定人參皂苷Rg1和人參皂苷Re含量。

色譜條件:Venusil MPC18(2)色譜柱(4.60mm×250mm,5μm),流動(dòng)相:乙腈-0.05%磷酸溶液(V/V);檢測(cè)波長(zhǎng)為316 nm;柱溫35℃,進(jìn)樣量:10μL。梯度洗脫條件見(jiàn)表3。

表3 高效液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫條件Table3 Gradient elution conditions for mobile phase of HPLC

對(duì)照品溶液的制備:精密稱取人參皂苷Rg1對(duì)照品和人參皂苷Re對(duì)照品,加色譜級(jí)甲醇制成0.20mg/mL的溶液。供試品溶液的制備:取酒液樣品過(guò)0.45μm膜濾。

測(cè)定方法:取已配制質(zhì)量濃度為0.11mg/mL、0.20mg/mL、0.30 mg/mL、0.45 mg/mL、0.55 mg/mL的Rg1對(duì)照品溶液,分別進(jìn)樣10μL,記錄色譜圖和峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo),人參皂苷Rg1質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),繪制人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程為Y=4 371.3X+10.224,R2=0.999 0。另精密吸取供試品溶液10μL注入HPLC色譜儀,記錄峰面積分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL,注入液相色譜儀測(cè)定,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中人參皂苷Rg1含量。

取已配制質(zhì)量濃度為0.11 mg/mL、0.20 mg/mL、0.30 mg/mL、1.00 mg/mL、0.45 mg/mL、0.55 mg/mL的Re對(duì)照品溶液,分別進(jìn)樣10μL,記錄色譜圖和峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo),人參皂苷Re質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),繪制人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程為Y=3 733.3X+5.708 3,R2=0.999 0。另精密吸取供試品溶液10μL注入HPLC色譜儀,記錄峰面積分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL,注入液相色譜儀測(cè)定,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中人參皂苷Re含量。

1.3.6 粗多糖含量的測(cè)定

樣品粗多糖沉淀:準(zhǔn)確吸取保健酒酒液5.00 mL,置于50 mL離心管中,加入20.00 mL無(wú)水乙醇,混勻,于4℃冰箱中靜置4 h以上,以9 000 r/min離心10 min,棄去上清液,殘?jiān)皿w積分?jǐn)?shù)為80%乙醇溶液洗滌,離心后棄去上清液,反復(fù)操作3次。殘?jiān)盟芙獠⒍ㄈ葜?00 mL。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.5g/L)0.10mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL置于25mL比色管中,補(bǔ)水至2.00mL,加入5%苯酚溶液1.00mL,在漩渦混合器上混勻,加入硫酸10.00mL,在漩渦混合器上小心混勻,置沸水浴中2.00 min,冷卻至室溫,在485 nm波長(zhǎng)處以實(shí)際空白為參比,測(cè)定吸光度值。以葡萄糖質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),吸光度值(Y)為縱坐標(biāo),繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程為Y=6.328 1X+0.007 5,R2=0.999 5。

樣品測(cè)定:準(zhǔn)確吸取100μL置于25 mL比色管中,補(bǔ)加水至2.00 mL,然后按照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制中的測(cè)定方法進(jìn)行吸光度值的測(cè)定,按照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中粗多糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 滲漉工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 滲漉溫度對(duì)滲漉工藝條件的影響

表4 溫度對(duì)滲漉工藝條件的影響Table4 Effect of temperature on percolation process conditions

由表4可知,滲漉流速在4～35℃范圍時(shí),阿魏酸、人參皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量隨溫度增大而增加;溫度為35℃時(shí),阿魏酸、人參皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量達(dá)到最大,分別為7.94mg/L、32.75mg/L、18.34mg/L、23658.46mg/L,藥材中的有效成分在較高溫度環(huán)境下更容易滲出。因此,選擇35℃為最佳滲漉溫度。

2.1.2 滲漉流速對(duì)滲漉工藝條件的影響

由表5可知,滲漉流速在0.20～0.80 mL/min范圍時(shí),阿魏酸、人參皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量隨滲漉流速增大而增加;滲漉流速為0.80 mL/min時(shí),阿魏酸、人參皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量達(dá)到最大,分別為6.01 mg/L、31.01 mg/L、17.95 mg/L、22 990.71 mg/L;滲漉流速＞0.80 mL/min之后,阿魏酸、人參皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量均有所下降,原因是藥材中的有效成分來(lái)不及滲出,滲漉液白酒已經(jīng)滴完。因此,選擇0.80 mL/min為最佳滲漉流速。

表5 滲漉流速對(duì)滲漉工藝條件的影響Table5 Effect of flow velocity on percolation process conditions

2.1.3 滲漉前浸泡時(shí)間對(duì)滲漉工藝條件的影響

表6 滲漉前浸泡時(shí)間對(duì)滲漉工藝條件的影響Table6 Effect of soak time before percolation on percolation process conditions

由表6可知,滲漉前浸泡時(shí)間在8～24 h范圍時(shí),阿魏酸、人參皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量隨滲漉前浸泡時(shí)間增大而增加;滲漉前浸泡時(shí)間為24 h時(shí),阿魏酸、人參皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量達(dá)到最大,分別為6.01 mg/L、31.01mg/L、17.95mg/L、22 990.71mg/L;滲漉前浸泡時(shí)間＞24 h之后,阿魏酸、人參皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量均有所下降,藥材中的有效成分滲出到一定程度達(dá)到極限,不能繼續(xù)滲出,隨著滲漉前浸泡時(shí)間延長(zhǎng),有效成分反而減少。因此,選擇24 h為最佳滲漉前浸泡時(shí)間。

2.2 滲漉工藝優(yōu)化正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果分析

9組滲漉完成后,經(jīng)高效液相色譜及紫外分光光度計(jì)檢測(cè)阿魏酸、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和粗多糖含量如表7所不。

表7 樣品中各指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果(n=2)Table7 Determination results of each index in the samples(n=2)

按表7的試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算,阿魏酸的標(biāo)準(zhǔn)差s1為2.41,Rg1的標(biāo)準(zhǔn)差s2為1.13,Re的標(biāo)準(zhǔn)差s3為1.52,粗多糖的標(biāo)準(zhǔn)差s4為3559.75。通過(guò)簡(jiǎn)易綜合評(píng)分法,將阿魏酸、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和粗多糖含量多指標(biāo)為單指標(biāo),計(jì)算出結(jié)果。

表8 滲漉工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table8 Results and analysis of orthogonal tests for percolation process optimization

由表8可知,3個(gè)因素對(duì)阿魏酸含量、人參皂苷Rg1、Re含量和粗多糖含量均有影響,通過(guò)極差值得大小得出影響因素順序依次為A＞B＞C,說(shuō)明影響女士保健酒滲漉工藝綜合評(píng)分中滲漉溫度和滲漉流速是主要因素,而滲漉前浸泡時(shí)間次之;由極差分析得出滲漉工藝最佳組合為A3B1C2,即滲漉溫度為36℃,滲漉流速為0.4 mL/min,滲漉前浸泡時(shí)間為24 h。

表9 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table9 Variance analysis of orthogonal tests results

由表9可知,滲漉溫度和滲漉流速對(duì)結(jié)果影響顯著(P＜0.05),滲漉前浸泡時(shí)間對(duì)結(jié)果影響不顯著(P＞0.05)。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證正交試驗(yàn)合理性按優(yōu)選出的最佳工藝條件A3B1C2,重復(fù)進(jìn)行3批樣品試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表10。

由表10可知,3批樣品所提得阿魏酸含量、人參皂苷Rg1、Re含量和粗多糖含量都接近正交試驗(yàn)中的36℃滲漉的最大值,表明此最佳工藝合理,可作為批量生產(chǎn)的工藝參數(shù)。

表10 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table10 Results of validation tests

3 結(jié)論

運(yùn)用正交設(shè)計(jì)方法進(jìn)行試驗(yàn),以求得最優(yōu)的滲漉工藝。在所選因素水平范圍內(nèi),按綜合加權(quán)評(píng)分法判定,影響女士保健酒滲漉工藝的因素依次為A＞B＞C,即滲漉溫度＞滲漉流速＞滲漉前浸泡時(shí)間,且滲漉溫度和滲漉流速為提取過(guò)程中的顯著影響因素(P＜0.05)。又因?yàn)槌貪B漉節(jié)約能耗和生產(chǎn)成本。故最終選擇A3B1C2為最佳滲漉條件,即36℃滲漉、流速選擇0.4 mL/min、滲漉前浸泡時(shí)間選擇24 h。在此優(yōu)化滲漉工藝條件下,綜合評(píng)分為9.66分,阿魏酸、人參皂苷Rg1、Re及粗多糖含量的分別為7.03 mg/L、31.86 mg/L、17.69 mg/L、22 647.20 mg/L。

本試驗(yàn)以阿魏酸、人參皂苷Rg1和Re和粗多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),篩選滲漉工藝,有利于兼顧各指標(biāo)的協(xié)同效應(yīng),符合中藥復(fù)方多成分多靶點(diǎn)起效的特點(diǎn),較單一指標(biāo)篩選更加科學(xué)、合理,而且操作方法簡(jiǎn)便,結(jié)果容易統(tǒng)計(jì),且優(yōu)化后的滲漉工藝結(jié)果穩(wěn)定可靠,可為進(jìn)一步開發(fā)女士保健酒提供重要依據(jù)。