生物活性肽功能及制備技術(shù)研究進展

余楠楠,陳 琛*

(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 漢中 723000)

生物活性肽是由2個或2個以上氨基酸組成的具有特殊活性的肽類,分子質(zhì)量一般＜6 kDa,構(gòu)成生物活性肽的氨基酸的組成及分子排列方式不同[3]。生物活性肽的制備方法包括酶水解法、化學(xué)水解法、微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法、基因重組法和多肽的提取分離純化。

在有關(guān)生物活性肽的研究方面,國外已將其作為疫苗、診斷藥物廣泛應(yīng)用于實踐中。而我國起步較晚,在許多研究上仍處于臨床前期的實驗過程。本文綜述了生物活性肽的種類和生物功能、生物活性肽的制備技術(shù)和分離純化方法進行了概述,重點闡述了酶解法、微生物發(fā)酵法制備生物活性肽的技術(shù)方法。

1 生物活性肽的種類及其功能

1.1 抗氧化肽

抗氧化肽具有清除自由基、抑制脂質(zhì)氧化以及與金屬離子螯合等能力,具有抗氧化作用[4]。抗氧化肽是維持人體抗氧化防御系統(tǒng)動態(tài)平衡的基礎(chǔ),可以抑制細(xì)胞氧化,減少許多因氧化產(chǎn)生的疾病。

HU F等[5]的研究中,用堿性蛋白酶水解山核桃蛋白分離物(pecan protein isolate,PPI)以產(chǎn)生抗氧化肽。利用動力學(xué)模型科學(xué)的解釋了PPI的酶解過程,通過分子質(zhì)量為10 kDa、5 kDa和3 kDa的截留膜超濾逐步分離PPI水解產(chǎn)物,體外評估抗氧化活性,成功純化得到了最強的抗氧化劑部分(＜3kDa)和新型抗氧化肽。純化的抗氧化肽氨基酸序列為Leu-Ala-Tyr-Leu-Gln-Tyr-Thr-Asp-Phe-Glu-Thr-Arg。純化部分的質(zhì)量濃度在0.1 mg/mL時對2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthi-azoline-6-sulphonate),ABTS]自由基,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基和羥基自由基的清除率分別為67.67%、56.25%、47.42%,具有顯著的抗氧化活性。

1.2 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽

高血壓是在全球范圍內(nèi)備受關(guān)注的一種心血管疾病,不僅患病率高,還有可能引發(fā)冠心病、心肌梗塞以及腎功能衰竭等疾病[6]。目前臨床上,高血壓主要依靠化學(xué)藥物進行治療,但有較大的副作用且極易產(chǎn)生依賴性[2],因此研發(fā)天然具有降血壓作用的生物活性肽引起人們諸多關(guān)注。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-Iconverting enzyme,ACE)是調(diào)節(jié)血壓的一種重要的酶。當(dāng)人體出現(xiàn)血壓過高的情況時,可使用ACE抑制肽來降血壓[7]。LIU C等[8]研究中,采用離子交換色譜,凝膠過濾色譜,反相高效液相色譜(reverse phasehigh-performanceliquid chromatography,RPHPLC)和液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography coupled withelectrospray ionizationtandemmassspectrometry,LC-ESI-MS/MS)純化和鑒定來自榛子的ACE抑制肽。鑒定出了3個新的ACE抑制肽Ala-Val-Lys-Val-Leu(AVKVL),Tyr-Leu-Val-Arg(YLVR)和Thr-Leu-Val-Gly-Arg(TLVGR),半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值分別為73.06μmol/L,15.42μmol/L和249.3μmol/L。3個新的ACE抑制肽通過非競爭模式抑制ACE活性。AVKVL,YLVR和TLVGR對ACE的結(jié)合自由能分別為-3.46kcal/mol,-6.48 kcal/mol和-7.37 kcal/mol。YLVR對ACE的強烈抑制可能歸因于陽離子-π相互作用的形成。

LIAOP等[9]將鱉甲用六種不同蛋白酶水解,木瓜蛋白酶制備的水解物比其他酶水解物對血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶(ACE)具有更強的抑制活性。通過超濾,凝膠過濾色譜,離子交換柱色譜和高效液相色譜連續(xù)純化兩種非競爭性ACE抑制肽,其氨基酸序列分別為Lys-Arg-Glu-Arg和Leu-His-Met-Phe-Lys,IC50值分別為324.1μmol/L和75.6μmol/L,證實鱉甲是具有ACE抑制活性的活性肽的潛在來源。此外,酶動力學(xué)和等溫滴定量熱法分析表明,與Lys-Arg-Glu-Arg相比,Leu-His-Met-Phe-Lys與ACE形成更穩(wěn)定的復(fù)合物,具有更好的抑制活性。TUM等[10]從酪蛋白水解產(chǎn)物中不斷鑒定出各種生物活性肽,通過超高效液相色譜-電噴霧-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(ultraperformanceliquid chromatography-electrospray ionization-quadrupoletimeof flightmass spectrometry,UPLC-ESI-Q-TOF-MS)聯(lián)用技術(shù)篩選和鑒定了一種新的血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制性肽Asn-Met-Ala-Ile-Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Asn-Leu-Cys-Ser-Thr-Phe-Cys-Lys,該肽來源于αs2-酪蛋白片段殘基25-41,通過高效液相色譜方法測定的肽的IC50值為129.07μmol/L。

1.自主創(chuàng)新條件逐步改善。國家把自主創(chuàng)新作為發(fā)展戰(zhàn)略，建立創(chuàng)新型國家，是要建立以企業(yè)為主體、市場為導(dǎo)向和產(chǎn)學(xué)研相結(jié)合的技術(shù)創(chuàng)新體系，使企業(yè)真正成為研究開發(fā)投入的主體、技術(shù)創(chuàng)新的主體和創(chuàng)新應(yīng)用成果的主體，全面提升企業(yè)的自主創(chuàng)新能力。我國的養(yǎng)豬業(yè)已逐步把自主創(chuàng)新能力放在行業(yè)發(fā)展的優(yōu)先地位上來，緊緊圍繞養(yǎng)豬服務(wù)于經(jīng)濟建設(shè)這個中心任務(wù)，著力解決制約養(yǎng)豬生產(chǎn)的重大科技問題，大幅提高行業(yè)競爭力。

1.3 抗菌肽

抗菌肽對真菌、細(xì)菌、病毒等有良好的抑制作用。如今抗生素的濫用引發(fā)許多安全問題,細(xì)菌耐藥性增強以及大量的藥物殘留迫使人們研究出安全無副作用的抗菌劑?？咕木哂锌咕钚詮娗也灰桩a(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點,為抗菌新藥的研發(fā)提供了方向。

BAOY等[11]的研究中,使用凝膠過濾色譜法純化了兩種類型的泥蚶血紅蛋白Tg-HbI和Tg-HbII,并且測量了它們的抗菌和過氧化物酶活性。結(jié)果顯不,泥蚶血紅蛋白可能通過天然分子的過氧化物酶活性和從蛋白質(zhì)釋放的一些內(nèi)部肽發(fā)揮宿主抗菌防御的作用。

章檢明等[12]利用瓊脂擴散法篩選產(chǎn)抗菌肽的菌株,運用細(xì)胞吸附解吸和陽離子交換層析法純化抗菌肽,篩選出的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)4121所產(chǎn)生的抗菌肽熱穩(wěn)定性及酸穩(wěn)定性良好,具有廣譜抑菌能力。

1.4 抗腫瘤肽

目前,癌癥已成為危害人類健康的一大疾病,其發(fā)病率與死亡率極高,人們對癌癥的預(yù)防和治療尤為重視。與傳統(tǒng)的化療藥物相比,抗腫瘤生物活性肽具有特異性強,毒副作用小,不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點[13],是抗腫瘤藥物研究開發(fā)的熱點。

抗腫瘤肽有許多來源,如牛奶,奶酪,大豆,蛋和軟體[14]。王楠等[15]采用Sephadex G-25凝膠柱層析分離,得到I,II,III,IV,V 5個抗腫瘤肽組分。再以不同質(zhì)量濃度(6.25～100μg/mL)的甲魚堿溶蛋白肽處理人肺癌A549細(xì)胞24 h。結(jié)果顯不,肽組分I,II,III,IV對人肺癌A549細(xì)胞有不同程度的抑制,且活性存在很大的差異。其中肽組分I的抗腫瘤活性最高,對A549細(xì)胞的最高抑制率均超過了60%,有很好的量效關(guān)系,半抑制濃度(50%inhibiting concentration,IC50)為32.26μg/mL。由此可判斷肽組分I在體外具有較好的抗腫瘤作用。

1.5 免疫調(diào)節(jié)肽

免疫調(diào)節(jié)肽具有促進和調(diào)節(jié)免疫功能的作用,是一種功能性化合物,在機體中起到重要的免疫調(diào)節(jié)作用。免疫是機體自身的免疫系統(tǒng)識別異己,產(chǎn)生免疫應(yīng)答排除異物的一種機體自我保護。具有免疫調(diào)節(jié)功能的生物活性肽包括寡肽、多肽和一些蛋白酶水解的混合肽[16]。

鄧志程[17]的研究中采用模擬消化酶水解法制備馬氏珠母貝全臟器免疫活性肽,同時探究了制備的馬氏珠母貝全臟器免疫活性寡肽對小鼠免疫活性的影響。結(jié)果表明,小鼠淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力顯著增強,小鼠的免疫應(yīng)答能力顯著提高。

LOZANO-OJALVO D等[18]研究肽的免疫調(diào)節(jié)作用,以及卵清蛋白,溶菌酶,卵類粘蛋白和全蛋清堿性蛋白酶水解產(chǎn)物對細(xì)胞因子的產(chǎn)生、抗體分泌,以及用T(伴刀豆球凝集素A,concanavalin A,con-A)或B細(xì)胞有絲分裂原脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的鼠脾和腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖的作用。結(jié)果表明,卵清蛋白、溶菌酶和全蛋清的堿性蛋白酶水解產(chǎn)物降低了con-A刺激的淋巴細(xì)胞增殖和Th2偏向白細(xì)胞介素-13(interleukin-13,IL-13)和IL-10的分泌,并減少了Th1細(xì)胞因子腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的產(chǎn)生?？山档鸵虍a(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性物質(zhì)對細(xì)胞的影響,增加細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用,酶水解全蛋白釋放的肽可以以不同方式調(diào)節(jié)小鼠細(xì)胞對有絲分裂原刺激的免疫反應(yīng)。

2 生物活性肽的制備技術(shù)

2.1 酶解法

酶解法制備生物活性肽具有較低的生產(chǎn)成本、較高的產(chǎn)品安全性、溫和的生產(chǎn)條件、易于控制進程等特點[19],故酶解法成為制備生物活性肽最常用的方法之一。表1列舉了采用酶解法從不同的原料中制備生物活性肽的條件、方法和功能活性。

表1 酶解法制備生物活性肽Table1 Bioactive peptides preparation by different raw materials hydrolysis

酶解法中蛋白酶的種類有很多,幾種常見的蛋白酶有胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等。蛋白酶催化蛋白質(zhì)中肽鍵的水解時,因水解條件(pH、溫度、時間等)不同會影響多肽鏈的長度、氨基酸順序和游離氨基酸的數(shù)量,從而影響水解產(chǎn)物的生理活性[29]。

WU Q等[23]使用胃蛋白酶,胰蛋白酶和β-胰凝乳蛋白酶水解蠶蛹蛋白質(zhì),并通過超濾,凝膠過濾層析和反相高效液相色譜依次純化水解產(chǎn)物。結(jié)果顯不,鑒定出一種新型的ACE抑制肽Ala-Ser-Leu,具有很強的ACE抑制活性,IC50值為102.15μmol/L。表明蠶蛹蛋白水解物可作為高血壓治療產(chǎn)品開發(fā)。唐蔚等[30]利用大孔吸附樹脂對南瓜籽抗氧化肽進行分離純化。結(jié)果顯不最優(yōu)的條件是:堿性蛋白酶、酶解pH=10.1、溫度52℃、時間120 min、底物濃度5.7%、加酶量2%,此條件下抗氧化性最為顯著。

在制備生物活性肽的方法中,優(yōu)先使用的方法便是酶水解法,尤其是在食品和藥物中,因為其最終產(chǎn)物中殘留的有機溶劑和有毒物質(zhì)較少。而且酶水解是一種在溫和條件下進行的方法,酶解條件很容易控制。通過將反應(yīng)介質(zhì)調(diào)節(jié)到酶的最佳pH和溫度,可以在連續(xù)的酶促反應(yīng)中使用多種酶進行水解[31]。在工業(yè)生產(chǎn)中,純化成本較高限制了高純度生物活性肽的生產(chǎn),可用固定化酶進行水解生產(chǎn)多肽,固定化酶允許在更溫和更受控制的條件下進行酶促水解,可以實現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn),而且固定化酶可回收,避免了酶產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物,產(chǎn)物易于分離純化。

2.2 微生物發(fā)酵法

與酶解法相比,微生物發(fā)酵法產(chǎn)物純化困難,有很多產(chǎn)酶菌株對機體產(chǎn)生毒害、效率低、安全性低等限制了該法的應(yīng)用[32]。

NIU L Y等[33]利用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B1發(fā)酵制備脫脂小麥胚芽肽(defatted wheat germ peptides,DWGPs),并研究DWGPs的抗氧化活性。結(jié)果顯不,發(fā)酵制備的DWGPs表現(xiàn)出對DPPH、羥基和超氧陰離子自由基清除活性的作用,表明脫脂小麥胚芽肽可作為食品工業(yè)中有前景的抗氧化物質(zhì)。JAIN S等[34]利用乳酸菌植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)發(fā)酵雞蛋殼膜,在初始pH 8.0條件下培養(yǎng)36 h獲得水解產(chǎn)物。發(fā)酵產(chǎn)生的水解產(chǎn)物具有優(yōu)異的溶解度(90.7%),良好的發(fā)泡能力(36.7%)和乳化活性(94.6 m2/g)。這些產(chǎn)物表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性、降高血壓活性、抗菌活性,可作為功能性食品的添加劑。

部分菌株微生物發(fā)酵法制備生物活性肽的條件和方法見表2。

表2 微生物發(fā)酵法制備生物活性肽Table2 Bioactive peptides preparation by different microbiological fermentation

2.3 其他制備方法

化學(xué)合成法目前在實驗室應(yīng)用較為廣泛,可分為液相合成法和固相合成法[43]。液相合成法可較好的合成小分子肽濃縮多肽片,固相合成法的固相載體對合成中肽鏈的固定、環(huán)化、去保護和純化較為有利,但成本高,副反應(yīng)和殘留化合物多,限制了大規(guī)模生產(chǎn)。

蛋白質(zhì)的化學(xué)水解法包括酸水解和堿水解。此方法因成本低和操作簡單而廣泛應(yīng)用于工業(yè),其缺點是水解過程難以控制,使用酸堿試劑對氨基酸的損害較為嚴(yán)重。

基因工程重組法生產(chǎn)多肽技術(shù)已經(jīng)趨于成熟,具有不受生產(chǎn)原料限制表達(dá)定向性強等優(yōu)點,但其僅限于大分子肽的合成,表達(dá)短肽鏈較為困難,且具有表達(dá)效率低等問題[43]。

2.4 產(chǎn)物分離與純化

生物活性肽的分離純化技術(shù)對生物活性肽的下一步研究應(yīng)用以及構(gòu)效關(guān)系確定非常重要。常用的分離純化技術(shù)有:色譜技術(shù)、電泳技術(shù)、膜分離技術(shù)。已經(jīng)在制備生物活性肽中得到廣泛應(yīng)用的色譜技術(shù)有大孔樹脂吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換樹脂層析、反相高效液相色譜等分離方法。多肽的分離純化非常復(fù)雜,使用單獨一種方法很難得到純品,而使用多種方法聯(lián)用來分離多肽可以提高多肽的純度和活性,但是產(chǎn)率較低。

鄧志程等[44]以馬氏珠母貝為原材料制備酶解液,利用Sephadex G-25凝膠柱層析、Capto Q強陰離子交換色譜等來分離純化和篩選馬氏珠母貝多肽酶解液,獲得2個免疫活性肽。

3 總結(jié)與展望

生物活性肽因來源廣泛、功能多樣,安全性高、價格低廉、特異性強等多種優(yōu)勢而受到越來越多國內(nèi)外研究學(xué)者的關(guān)注,生物活性肽產(chǎn)品開發(fā)具有較好的前景。目前生物活性肽產(chǎn)品較少,已上市產(chǎn)品價格昂貴,雖然生物活性肽的制備及分離純化技術(shù)得到了迅速發(fā)展,但是仍然存在一定的問題,色譜純化產(chǎn)品收率低,精制成本高,導(dǎo)致產(chǎn)品價格昂貴,影響后端產(chǎn)品銷售,非精制產(chǎn)品雜質(zhì)多,功效低,還會存在過敏原等。水解法制備生物活性肽還存在水解率低、原料的利用率較低等問題。但是相信隨著生物活性肽生產(chǎn)技術(shù)方法的發(fā)展和生產(chǎn)設(shè)備的不斷進步,生物活性肽的深加工品必將會應(yīng)用到功能食品、醫(yī)藥、化妝品等多個領(lǐng)域。