代謝工程改造釀酒酵母生產(chǎn)2,3-丁二醇的研究進展

劉德安,王長麗,丁 昊,葛菁萍,2*

(1.黑龍江大學生命科學學院 微生物學黑龍江省高校重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150080;2.農(nóng)業(yè)微生物技術教育工程研究中心,黑龍江 哈爾濱 150500)

隨著當今社會經(jīng)濟的蓬勃發(fā)展,能源短缺逐漸成為人類發(fā)展進程的絆腳石,所以開發(fā)綠色新能源,減緩石油危機迫在眉睫[1]?；卺劸平湍?Saccharomyces cerevisiae)全基因組測序的完成,利用代謝工程手段對S.cerevisiae進行遺傳學改造,為實現(xiàn)生物燃料如乙醇、2,3-丁二醇(2,3-butanediol,2,3-BD)的工業(yè)化生產(chǎn)提供了保障[2]。此方法的興起不但能在保護生態(tài)環(huán)境的同時發(fā)展經(jīng)濟,實現(xiàn)能源結構的綠色轉型,更是響應“十一五”發(fā)展規(guī)劃、推動節(jié)能減排號召的一種有效手段。

繼乙醇之后,2,3-BD是一種性價比較高的新興能源化合物,廣泛應用于航空航天、食品、醫(yī)藥等領域。2,3-BD脫羧化反應合成乙偶姻(acetoin)和雙乙酰(2,3-butanedione),可以作為食品風味添加劑等[3]。20世紀中期,以石油為原料化學法合成2,3-BD一直占據(jù)主導地位。直到20世紀后期,特別是21世紀以來,石油危機、糧食短缺和環(huán)境污染等問題的日益加劇,使得生物法合成2,3-BD又重新吸引了國內外學者的目光,對其的研究再次成為了關注的熱點[4]。2,3-BD的結構式如下:

自然界存在許多天然合成2,3-BD的微生物(見表1),如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)[5]、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)[6]、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)[7]、多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)[8]、S.cerevisiae[9],這些微生物能應用代謝工程策略提高2,3-BD的生產(chǎn)性能。因此,有研究利用敲除副產(chǎn)物合成途徑的關鍵酶編碼基因的手段來提高2,3-BD的產(chǎn)量[10-12]。SANGPROO M等[13]在K.oxytoca細胞內敲除副產(chǎn)物合成途徑中的乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALDA)、乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH),最終使工程菌株的2,3-BD產(chǎn)量達到114 g/L。利用代謝工程手段雖然能有效地提高細菌2,3-BD的產(chǎn)量,但諸如克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.)和腸桿菌屬(Enterobacter sp.)等細菌大都是條件致病菌,違反了綠色安全工業(yè)化生產(chǎn)的標準[13]。因此,利用公認安全無毒(generally regarded assafe,GRAS)微生物S.cerevisiae改造合成2,3-BD的代謝途徑成為新的研究熱點[14]。

近代以來隨著代謝工程原理與技術的不斷深入研究,關于S.cerevisiae產(chǎn)2,3-BD代謝途徑改造的深入探索,改造方法和手段的不斷創(chuàng)新,2,3-BD的生產(chǎn)得到了大幅度增加。本研究總結了近年來利用代謝工程原理和方法對S.cerevisiae代謝網(wǎng)絡進行重新設計和合理改造的三種策略。并展望未來S.cerevisiae的重點研究方向。

表1 產(chǎn)2,3-BD的微生物Table1 2,3-butanediol-producing microorganism

1 微生物中2,3-BD的代謝途徑

在細菌的2,3-BD代謝途徑中(見圖1A),糖類物質經(jīng)糖酵解途徑(embden meyerhof pathway,EMP)變?yōu)楸?丙酮酸經(jīng)α-乙酰乳酸合成酶(α-acetolactatesynthase,ALS)、α-乙酰乳酸脫羧酶(α-acetolactatedecarboxylase,ALDC)和乙偶姻還原酶(acetoin reductase,AR)或稱2,3-BD脫氫酶(2,3-butanediol dehydrogenase,BDH)3個關鍵酶共同催化后合成α-乙酰乳酸、乙偶姻和2,3-BD[19]。這一系列反應是酸性發(fā)酵過程,所以會伴隨著甲酸、丁二酸、乙酸、蘋果酸等酸性副產(chǎn)物的生成。

圖1 細菌(A)和釀酒酵母(B)中的2,3-BD代謝途徑Fig.1 Metabolic pathway of 2,3-butanediol in bacteria(A)and Saccharomyces cerevisiae(B)

S.cerevisiae自身的2,3-BD代謝途徑(見圖1B)不完整,S.cerevisiae胞內有兩條2,3-BD合成途徑,第一條途徑是丙酮酸被α-乙酰乳酸合成酶催化生成為α-乙酰乳酸,α-乙酰乳酸通過自身氧化脫羧生成雙乙酰,在BDH1的催化下生成乙偶姻;第二條途徑是丙酮酸經(jīng)丙酮酸脫羧酶(pyruvatedecarboxylase,PDC)催化生成乙醛,乙醛在乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)的作用下生成乙醇,或者丙酮酸在PDC的作用下直接生成乙偶姻;最后,乙偶姻在BDH1的催化作用下生成終產(chǎn)物2,3-BD。與細菌合成2,3-BD的合成途徑相比,S.cerevisiae中沒有ALDC,不能通過酶促反應合成乙偶姻,但是在氧氣存在的條件下,S.cerevisiae中α-乙酰乳酸自發(fā)脫羧生成雙乙酰,在BDH1的催化作用下將雙乙酰還原為2,3-BD。

2 釀酒酵母合成2,3-BD的代謝途徑改造策略

之前,國內外學者一直利用傳統(tǒng)的誘變育種技術(如物理誘變、化學誘變)來提高菌種的產(chǎn)量和性能,但這種方式具有隨機性強、可塑性弱且工作量大等弊端。因此,基于全基因組的系統(tǒng)代謝工程和輔酶調控策略對關鍵代謝節(jié)點進行合理的遺傳改造逐漸吸引了學者眼球。通過優(yōu)化S.cerevisiae合成2,3-BD的途徑,阻斷乙醇、甘油兩條主要的競爭代謝支路進而強化生物合成2,3-BD,有望快速獲得遺傳穩(wěn)定性好、發(fā)酵水平顯著提高的S.cerevisiae。

2.1 過表達關鍵酶基因

GONZáLEZE等[20]研究發(fā)現(xiàn),在酵母細胞代謝過程中丙酮酸脫羧酶可以將乙醛和丙酮酸轉化成乙偶姻,但碳代謝流向微弱,乃有痕量的2,3-BD產(chǎn)生。因此,有必要對2,3-BD生物合成途徑中關鍵酶進行過表達,并減少S.cerevisiae中分支代謝產(chǎn)物,用于提高2,3-BD的產(chǎn)量。

S.cerevisiae中存在兩條代謝通路,丙酮酸可以通過乙醛或α-乙酰乳酸兩條代謝路徑生成乙偶姻。因此,可以參考細菌2,3-BD的改造策略,如圖2A所不。LIANJ等[21]通過過表達丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvate formate-lyase,PLFA)基因(pfl A,pfl B)、乙醛脫氫酶基因(mhp F)來增強乙醛的代謝途徑,同時敲除adh1、adh3和adh5基因抑制或減弱通往乙醇的代謝流,敲除自身2,3-BD生物合成的基因(ilv2),防止受自身代謝影響,引導代謝通路最終由產(chǎn)乙醇代謝轉向產(chǎn)2,3-BD,進而提高S.cerevisiae產(chǎn)2,3-BD的水平,通過分批補料發(fā)酵,2,3-BD的產(chǎn)量達到0.307 g/L,是野生型S.cerevisiae 2,3-BD產(chǎn)量的7.3倍,乙醇產(chǎn)量降低7.7%;BRACKMAN G等[22]通過異源過表達來自枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的乙酰脫氫酶基因E1組分的aco A、aco B來提高乙酰-CoA與乙醛合成乙偶姻的能力(見圖2B),在敲除adh1、adh3、adh5和ilv2基因的基礎上,過表達pfl A、pfl B、aco A、aco B及內源性的bdh1基因,構建工程菌株進行分批補料發(fā)酵,2,3-BD產(chǎn)量達到0.341 g/L。由此說明乙醛途徑基因的過表達對增強S.cerevisiae的2,3-BD產(chǎn)量無顯著效果。

因此,最近的研究集中在α-乙酰乳酸合成途徑上。由于α-乙酰乳酸的自發(fā)氧化脫羧是S.cerevisiae 2,3-BD合成途徑中的限速步驟。為解決這一問題,在S.cerevisiae中異源表達胞質als和aldc基因,可使α-乙酰乳酸直接將α-乙酰乳酸轉化為乙偶姻,最終合成2,3-BD[23]。由圖2C可知,KIM SR等[24]在S.cerevisiae中異源表達B.subtilis中的als和aldc基因并且過表達bdh1基因,通過分批補料發(fā)酵,2,3-BD產(chǎn)量達到0.69 g/L,是野生型S.cerevisiae 2,3-BD產(chǎn)量的115倍。綜上所述,異源過表達α-乙酰乳酸合成途徑中的2,3-BD關鍵酶基因更能直接的提高2,3-BD產(chǎn)量。

圖2 釀酒酵母中基因過表達與基因敲除策略Fig.2 Strategies of gene overexpression and gene knockout in Saccharomyces cerevisiae

2.2 敲除adh和pdc基因減少副產(chǎn)物形成

研究者發(fā)現(xiàn),雖然過表達各種2,3-BD生物合成途徑中的關鍵酶基因能提高2,3-BD的產(chǎn)量,但2,3-BD產(chǎn)量的提高程度并不理想[24]。大量乙醇的積累嚴重制約著代謝流向2,3-BD,因此,在這種情況下,阻斷或弱化乙醇的代謝流進而加大2,3-BD產(chǎn)量是至關重要的。由圖1B可知,S.cerevisiae代謝途徑中的PDC能將丙酮酸轉化為乙醛,并在ADH作用下進一步還原成乙醇。因此,采用敲除adh基因(圖2C)或pdc基因(圖2D)兩種代謝工程策略,將乙醇代謝通路阻斷是切實可行的。

LEEJ等[25]敲除S.cerevisiae中的adh1、adh3、adh5基因后進行分批發(fā)酵,2,3-BD的產(chǎn)量達到2.29 g/L,與野生型S.cerevisiae相比,乙醇的產(chǎn)量降低31.25%,而2,3-BD的葡萄糖轉化率顯著提高,為0.113 g/g;KIM S等[26]在Adh-S.cerevisiae菌株基礎上,異源過表達B.subtilis中的als S和als D基因和內源bdh1基因后進行分批補料發(fā)酵,2,3-BD產(chǎn)量達到了29.1 g/L。理論上講,在抑制乙醇代謝流向并過表達2,3-BD合成途徑后,菌株可以利用葡萄糖經(jīng)丙酮酸、α-乙酰乳酸、乙偶姻合成2,3-BD,或經(jīng)丙酮酸和乙醛轉化成乙偶姻,最終合成2,3-BD(見圖2C)。但弊端是Δadh1、Δadh3、Δadh5會積累大量的毒性物質乙醛,且還會生成一定量的乙醇[27]。

為了完全抑制乙醇的積累并高效地積累丙酮酸,科研工作者再次嘗試以Pdc-S.cerevisiae菌株作為出發(fā)菌株(見圖2D),從根本上解決乙醇大量積累的問題。由于Pdc-S.cerevisiae菌株不能合成乙醛,進而不能生成乙酰-CoA,而乙酰-CoA是三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cyle,TCA)循環(huán)的關鍵物質,因此,菌株代謝生長受到嚴重抑制。在這種情況下,通過補充C2化合物(如乙醇、乙酸)可以緩解由乙酰-CoA缺失導致的細胞生長受抑制的情況,并顯著增加2,3-BD的產(chǎn)量。此外,通過表達mth1A轉錄調節(jié)因子也可以達到緩解細胞抑制現(xiàn)象,KIM SJ等[16]敲除Pdc-S.cerevisiae菌株中的pdc、ilv2基因和過表達細菌的2,3-BD基因(als S、als D、bdh1)和mth1A基因后,在微需氧條件下補料分批發(fā)酵,2,3-BD產(chǎn)量為96.2 g/L,并且沒有檢測到乙醇和丙酮酸積累。

2.3 減緩釀酒酵母合成2,3-BD過程中輔因子平衡問題

在酵母細胞的生物轉化過程中,常常包含了復雜的生化反應,且需要大量的輔因子參與調控,其中輔因子供給不足常常是影響代謝的關鍵因素。IDAY等[28]在Adh-S.cerevisiae或Pdc-S.cerevisiae菌株中引入2,3-BD代謝途徑后,會導致葡萄糖流向2,3-BD的代謝過程的煙酰胺腺嘌吟二核甘酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid,NADH)/NAD+比例不平衡。原因是S.cerevisiae在糖酵解途徑中產(chǎn)生了2 mol NADH,但乃有1 mol NADH在2,3-BD途徑中被氧化成NAD+。一般來說,S.cerevisiae可以通過乙醇和甘油的合成途徑消耗掉多余的1mol NADH,從而維持胞內輔酶NADH/NAD+的平衡[29]。但工程菌株Adh-S.cerevisiae或Pdc-S.cerevisiae阻斷了代謝過程中乙醇的合成支路。因此,若要維持輔酶NADH/NAD+平衡,細胞乃有通過大量積累甘油來實現(xiàn)胞內NAD+的再生。為了保證2,3-BD合成的同時,最大程度的減少甘油的積累,將碳通量引流向2,3-BD合成支路是接下來需要考慮的問題。EHSANIM等[30]提出了增加供氧的策略,在敲除ilv2基因并過表達als、aldc和bdh1基因的S.cerevisiae中增加溶氧量,甘油積累減少的同時,葡萄糖合成2,3-BD的理論產(chǎn)量比厭O2條件下高20%。這說明通過改變溶氧調節(jié)氧化還原平衡對于生產(chǎn)2,3-BD具有重要意義。

此外,科研工作者們還提出了另一種辦法,通過外源添加替代電子受體的策略來緩解甘油的積累。如KAWAIS等[23]利用2-丁酮(2-butanone)作為外源添加電子受體用以緩解過量的NADH,甘油的產(chǎn)量降低了56%,2,3-BD的產(chǎn)率提高了1.5倍,達到了2,3-BD理論產(chǎn)率的90%。出于此目的,KIM S等[15]發(fā)現(xiàn)NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)可以將NADH氧化成NAD+,為了降低NADH的濃度,在過表達als、aldc、bdh1基因的Adh-S.cerevisiae工程菌株中外源表達乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中的NADH氧化酶,從而將C代謝甘油流向2,3-BD。通過分批補料發(fā)酵,2,3-BD產(chǎn)量達到73 g/L,與出發(fā)菌株相比,甘油的產(chǎn)量降低了65.3%,2,3-BD的產(chǎn)量提高了23.8%。

2.4 利用廉價原料合成2,3-BD

在S.cerevisiae中除過表達2,3-BD合成途徑、敲除副產(chǎn)物途徑提高2,3-BD產(chǎn)量外,也可以通過代謝工程手段使工程菌株具備利用廉價原料(木質纖維素(lignocellulose)和藻類(algae))生產(chǎn)2,3-BD的能力,進而提高2,3-BD產(chǎn)量。木質纖維素水解成葡萄糖和木糖后,葡萄糖能被S.cerevisiae利用,但木糖不能被利用[31]。因此,為了使S.cerevisiae能夠利用木糖,首先要解決的問題是關于代謝過程中存在的糖抑制現(xiàn)象,即當環(huán)境中存在葡萄糖時葡萄糖會抑制木糖的代謝。BAEY H等[32]發(fā)現(xiàn),在纖維素中存在一種兩個葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵組成的纖維二糖不會受其他糖類代謝抑制。為了利用纖維二糖產(chǎn)2,3-BD,NAN H等[17]在Pdc-S.cerevisiae菌株中外源導入纖維糊精轉運蛋白(cellodextrin transporter,CDT)基因和粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)中的β-葡糖苷酶(β-glucosidase)基因(見圖3),通過補料分批發(fā)酵,工程菌株的2,3-BD產(chǎn)量達到5.29 g/L,葡萄糖轉化率為0.29 g/g,這表明了纖維素水解產(chǎn)物可以持續(xù)有效的進行2,3-BD的生產(chǎn)。其次要解決的問題是如何利用木糖生產(chǎn)2,3-BD,JO SE等[33]在過表達als、aldc和bdh1基因的Pdc-S.cerevisiae菌株中過表達木糖發(fā)酵酵母(Scheffersomyces stipitis)的木糖醇脫氫酶(xylitol dehydrogenase,XDH)基因和內源性木酮糖激酶(xylulose kinase,XK)基因,構成異源木糖同化途徑(見圖3),構建完成的工程菌株進行補料分批發(fā)酵,2,3-BD產(chǎn)量達到44 g/L。綜上,S.cerevisiae可以通過代謝工程的技術利用木質纖維素產(chǎn)2,3-BD。

圖3 釀酒酵母中纖維二糖和藻類生物質單糖的2,3-BD生物合成途徑Fig.3 2,3-BD biosynthetic pathway of cellobiose and algal biomass monosaccharides in Saccharomyces cerevisiae

藻類作為另外一種可再生的生物質能源與纖維素生物質相比具有許多優(yōu)點,如藻類的生產(chǎn)不會占用耕地,所需水資源少[34]。在海洋大型藻類中,紅藻中的天竺葵(Pelargonium hortorum Bailey)最為豐富,其水解產(chǎn)物由葡萄糖和半乳糖組成。為了能夠同時利用葡萄糖和半乳糖產(chǎn)2,3-BD,MITSUI K等[35]在過表達als、aldc和bdh1基因的Pdc-S.cerevisiae菌株中表達Mth1p基因后,菌株可以同時消耗葡萄糖和半乳糖,通過補料分批發(fā)酵,優(yōu)化葡萄糖與半乳糖的比例,菌株的2,3-BD產(chǎn)量達到100 g/L,葡萄糖轉化率為0.353 g/g。

3 總結與展望

21世紀以來,通過引用新型的代謝工程技術,工程菌株S.cerevisiae產(chǎn)2,3-BD的能力顯著提升。此外,研究者建立了利用可再生能源來生產(chǎn)2,3-BD的方法[36]。S.cerevisiae利用可再生能源生產(chǎn)2,3-BD是有一定經(jīng)濟效益和具有可持續(xù)發(fā)展的前景[37]。展望未來,應從以下幾個方面進行后續(xù)的研究。

(1)深入了解S.cerevisiae產(chǎn)2,3-丁二醇的代謝途徑和分支代謝途徑,利用基于全基因組的系統(tǒng)代謝工程和輔酶調控策略對關鍵代謝基因進行合理的遺傳改造,例如,人工合成基因線路技術、啟動子工程技術以及基因組編輯技術等優(yōu)化2,3-BD的代謝途徑。

(2)開發(fā)利用可再生能源產(chǎn)2,3-丁二醇,有些可再生能源木質纖維素(如菊芋(Helianthustuberosus(L.1753)))水解液中的毒性物質含量相對較少,并且水解液中含有豐富的營養(yǎng)物質,這有利于S.cerevisiae產(chǎn)2,3-丁二醇,通過優(yōu)化木質纖維素的種類與水解方式以期得到更加適合S.cerevisiae生長和產(chǎn)2,3-BD的培養(yǎng)條件。