山皮條水提物急性毒性試驗及鎮(zhèn)痛抗炎藥效研究

云南省藥物研究所/云南白藥集團創(chuàng)新研發(fā)中心/云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點實驗室，云南 昆明 650111

山皮條為瑞香科Thymelaeaceae植物WikstroemiadolichanthaDiels，別名矮陀陀、竹臘皮。落葉小灌木，葉卵形或橢圓形，主根長圓錐形，有支根及少量須根，藥用部分為其根皮。味辛、辣，微苦，性微溫[1]。主要分布于四川、云南、貴州等地，多生長于石灰?guī)r地帶的向陽山坡上[2]。《滇南本草》中記載：山皮條“治婦人氣逆，肚腹疼痛，寬中理氣，胸膈肚腹膨脹，止面寒梗硬脹痛”?！独ッ髅耖g常用草藥》中亦記載：山皮條“寬中理氣，解郁，除瘡毒。治肚腹冷痛，胸膈氣脹，癆熱，瘡毒。”民間亦多用其治惡瘡[2]。據此推斷山皮條具有鎮(zhèn)痛、抗炎之功效。實驗對山皮條水提物進行小鼠灌胃給藥急性毒性實驗觀察其安全性，采用醋酸致小鼠扭體實驗和二甲苯致小鼠耳腫脹實驗分別考察其鎮(zhèn)痛、抗炎作用，為山皮條水提物的臨床安全及應用提供實驗依據。

1 儀器與材料

1.1 實驗動物 SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，周齡4～6周，體重18～22 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)2013-0002。飼養(yǎng)條件：室溫為(25±2)℃，相對濕度40%～70%，塑料盒群養(yǎng)。喂SPF大小鼠生長繁殖飼料，自由飲水和進食。飼料生產于北京科澳協(xié)力飼料有限公司，許可證號：SCXK(京)2014-0010。

1.2 藥品與試劑 山皮條水提物(批號：20151019，淺棕色粉末，提取率18.2%，云南省藥物研究所化學研究室)。羧甲基纖維素鈉(批號：20160602，國藥集團化學試劑有限公司)；阿司匹林腸溶片(批號：BJ22649，Bayer Schering Pharma公司)；乙酸(批號：1202101，上海申博化工有限公司)；生理鹽水(批號：A150413 G2，昆明南疆制藥有限公司)；二甲苯(批號：20140701，重慶川東化工(集團)有限公司)。

1.3 儀器 JJ-2000 型電子天平(美國雙杰兄弟(集團)有限公司常熟市雙杰測試儀器廠)；PL-203型電子分析天平(METTER-TOLEDO(上海)有限公司)；ELGALA 613型超純水機(英國ELGA LabWater/VWS(UK)Ltd )。

2 方法

2.1 小鼠灌胃給藥急性毒性實驗[3]

2.1.1 預試驗 山皮條水提物能配制較高且利于小鼠灌胃的混懸液的濃度為0.5 g/mL(20.00 g/kg·bw)，以0.8倍作為劑量設置比，共設四個劑量，分別為20.00 、16.00、12.80、10.24 g/kg·bw劑量組(分別相當于生藥109.89、87.91、70.33、56.26 g/kg·bw)。取SPF 級昆明種小鼠16 只，體重18～22 g，雌雄各半，實驗前禁食不禁水6 h，隨機分為4組，每組4只，雌雄各半，以灌胃最大容積40 mL/kg·bw分別灌胃給予相應劑量藥物，觀察動物一般癥狀及死亡情況，連續(xù)觀察7 d。

2.1.2 LD50實驗 根據小鼠灌胃給藥急性毒性預試驗結果，將山皮條水提物設置6個劑量組，即24.00、20.40、17.34、14.74、12.53、10.65 g/kg·bw(分別相當于生藥131.87、112.09、95.27、80.99、68.85、58.52 g/kg·bw)，另設溶媒對照組(0.5%羧甲基纖維素鈉溶液)。

取SPF 級昆明種小鼠70只，體重18～22 g，雌雄各半，隨機分為7組，即溶媒對照組和不同劑量山皮條水提物組，每組10只，雌雄各半。小鼠禁食不禁水6 h后，山皮條水提物各劑量組按40 mL/kg體積灌胃給予相應供試品，溶媒對照組灌胃給予相同容積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，觀察給藥后小鼠急性毒性反應、死亡情況、攝食量、二便、體重等情況，以后每天至少觀察1次，連續(xù)觀察14 d。對觀察期死亡的動物進行解剖，觀察結束后脫頸椎處死存活的動物，大體解剖觀察各臟器、器官的體積、顏色、質地等有無異常。

2.2 醋酸致小鼠扭體實驗[4]取SPF 級昆明種小鼠60只，體重18～22 g ，雌雄各半，隨機分為5組，即模型對照組、阿司匹林組(400 mg/kg·bw)、山皮條水提物低、中、高劑量組(劑量分別為1.58、3.15、6.30 g/kg·bw)，每組12只。模型對照組按20 mL/kg體積灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，其余各組按20 mL/kg的體積灌胃給予相應藥物，每天1次，連續(xù)7 d。末次給藥1 h后，按10 mL/kg體積腹腔注射0.6%的冰醋酸溶液(純水配制)，記錄注射后15 min內小鼠出現(xiàn)扭體反應(腹部內凹、伸展后肢、臀部抬高)的次數，并按下式計算其扭體抑制率：

扭體抑制率(%)=(1-給藥組扭體次數/模型對照組扭體次數)×100%。

2.3 二甲苯致小鼠耳腫脹實驗[5]取SPF 級昆明種小鼠60只，體重18～22 g，雌雄各半，隨機分為5組，即模型對照組、阿司匹林組(400 mg/kg·bw)、山皮條水提物低、中、高劑量組(劑量分別為1.58、3.15、6.30 g/kg·bw)，每組12只。模型對照組小鼠按20 mL/kg體積灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，其余各組按20 mL/kg的體積灌胃給予相應藥物，每天1次，連續(xù)7 d。末次給藥1 h后，各組小鼠于右耳耳廓兩面按0.05 mL/只均勻涂抹二甲苯，左耳不做處理為對照。造模1 h后，脫頸椎處死各組動物，沿耳廓基線剪下雙耳，用直徑6 mm的打孔器于雙耳同一部位切下等面積耳片，立即稱重，按下式計算耳腫脹度和腫脹抑制率： 耳腫脹度=右耳質量-左耳質量 腫脹抑制率=(模型對照組平均腫脹度- 給藥組平均腫脹度)/模型對照組平均腫脹度×100%。

2.4 統(tǒng)計學分析 實驗數據以均數加減標準差(x±SD)的方式表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析比較組間數據，方差齊者用LSD檢驗，方差不齊則采用Dunnett's T3檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 小鼠灌胃給藥急性毒性實驗 小鼠灌胃給藥急性毒性預試驗中，20.00、16.00、12.80、10.24 g/kg·bw劑量組死亡動物數分別為4只、2只、1只、0只，死亡率分別為100%、50%、25%、0%。各組小鼠給藥后主要出現(xiàn)俯臥、腹瀉、翻正反射消失等中毒癥狀，直至死亡。死亡動物解剖觀察，發(fā)現(xiàn)全部動物出現(xiàn)肺部充血現(xiàn)象。

正式實驗中，小鼠灌胃給予山皮條水提物后，在0.5～4 h內出現(xiàn)毒性反應，主要表現(xiàn)為俯臥、腹瀉、抽搐、翻正反射消失等癥狀直至死亡。動物給藥后49 min開始有小鼠死亡，死亡時間集中在給藥后48 h內，對死亡動物解剖觀察，全部動物出現(xiàn)肺部充血現(xiàn)象，但未進一步進行病理檢測。毒性反應癥狀發(fā)生時間和程度隨給藥劑量的降低而減輕，死亡動物數也相應減少。剩余小鼠行為活動逐漸趨于正常，至給藥第3天恢復，試驗期間，各組存活小鼠體重均持續(xù)增長。各組動物的毒性癥狀和死亡數量見表1。

觀察期結束后脫頸椎處死存活的動物，進行大體解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、卵巢、子宮、精囊、前列腺、睪丸、胃、腸及胸腔、腹腔，各臟器、器官的體積、顏色、質地等均無肉眼可見的異常。

在本實驗所設計的實驗條件和劑量范圍內，山皮條水提物24 h內小鼠灌胃給藥LD50為15.48 g/kg·bw(相當于生藥85.05 g/kg·bw)，95%的可信區(qū)間為14.07～16.99 g/kg·bw(相當于生藥量77.31～93.35 g/kg·bw)。

表1 山皮條水提物小鼠灌胃給藥急性毒性試驗各組動物毒性癥狀及死亡數

3.2 醋酸致小鼠扭體實驗 山皮條水提物以1.58、3.15、6.30 g/kg·bw(相當于生藥8.68、17.31、34.62 g/kg·bw)的劑量(給藥劑量由小鼠灌胃給藥急性毒性實驗及藥效實驗預試驗得出)連續(xù)灌胃給藥7 d，與模型對照組比較，山皮條水提物3.15 g/kg·bw、6.30 g/kg·bw劑量組均能顯著減少醋酸所致小鼠扭體反應的次數，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。提示山皮條水提物具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，見表2。

表2 山皮條水提物對醋酸所致小鼠扭體反應的影響(n=12，±SD)

注：與模型對照組比較，**P<0.01,***P<0.001。

3.3 二甲苯致小鼠耳腫脹實驗 山皮條水提物以1.58、3.15、6.30 g/kg·bw g(相當于生藥8.68、17.31、34.62 g/kg·bw)的劑量連續(xù)灌胃給藥7 d，與模型對照組比較，6.30 g/kg·bw劑量組能顯著降低二甲苯所致的小鼠耳腫脹度，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。提示山皮條水提物具有抗炎的作用，見表3。

表3 山皮條水提物對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(n=12，x±SD)

注：與模型對照組比：**P<0.01。

4 討論

山皮條盛產于云南、四川等地，《滇南本草》中記載其主治肚腹疼痛，能止面寒梗硬脹痛[1]，民間亦多用其除瘡毒，治肚腹冷痛[6]，但目前國內外對其藥理作用的報道較少，杜仕榕[2]對山皮條的臨床應用加以整理，將其佐以其他藥材治療慢性副鼻竇炎、尿路感染、乳腺炎等多種疾病，能清熱敗火、消炎祛毒，臨床療效確切。本實驗對山皮條水提物進行小鼠灌胃給藥急性毒性實驗觀察其安全性，采用醋酸致小鼠扭體實驗和二甲苯致小鼠耳腫脹實驗分別觀察其鎮(zhèn)痛、抗炎作用。

在急性毒性實驗中，小鼠灌胃給予山皮條水提物后，在0.5～4 h內出現(xiàn)毒性反應，主要表現(xiàn)為俯臥、腹瀉、抽搐、翻正反射消失等癥狀直至死亡，死亡動物全部出現(xiàn)肺部充血現(xiàn)象，由此推測山皮條對小鼠毒性作用可能涉及中樞神經、自主神經、肌肉及肺部等，相關機制有待進一步研究。試驗期間，各組存活小鼠體質量均持續(xù)增長，但由于動物死亡較多，未對存活小鼠體質量進行統(tǒng)計。山皮條水提物24 h內小鼠單次灌胃給藥LD50為15.48 g/kg·bw(相當于生藥85.05 g/kg·bw)，95%的可信區(qū)間為14.07～16.99 g/kg·bw(相當于生藥量77.31～93.35 g/kg·bw)，其毒性反應癥狀發(fā)生時間和程度隨給藥劑量的降低而減輕，死亡動物數量也相應減少，顯示出劑量-反應關系。提示山皮條具有一定的毒性，在臨床使用中要嚴格掌握其用量，避免使用過量而發(fā)生中毒。

醋酸致小鼠疼痛性扭體模型是目前國內外鎮(zhèn)痛藥物篩選的常用方法[7-8]，主要考察受試藥物的外周鎮(zhèn)痛作用，也適用于中樞鎮(zhèn)痛藥物的藥理研究[9]，適于非甾體抗炎藥鎮(zhèn)痛藥效的篩選[10]。其利用醋酸產生的化學刺激導致小鼠腹腔持久性疼痛，同時伴隨急性炎癥反應，刺激其臟層和壁層腹膜，引起小鼠疼痛性扭體反應[11-13]。結果表明，山皮條水提物能明顯減少小鼠疼痛性扭體的次數，具有一定的鎮(zhèn)痛作用。二甲苯是化學致炎劑，對皮膚黏膜有較強的刺激作用，能誘導炎性物質的釋放，導致毛細血管擴張、通透性增加、急性滲出和水腫等，與臨床炎癥癥狀相似，故常用于抗急性炎癥藥物的篩選[14-15]。實驗結果表明，山皮條水提物能明顯抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹，具有一定的抗炎作用。

綜上，山皮條水提物具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用，其作用機制還需進一步的研究；但也有一定的毒性，在臨床使用中要嚴格掌握其用量。